利用神经网络预测头孢菌素C的生物合成(一)
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作者：冀志霞 储炬 庄英萍 张嗣良
【关键词】 头孢菌素C；,,反向传播；,,神经网络；,,预测
摘要： 利用头孢菌素C发酵过程积累的数据，建立BP神经网络预估模型，实现以发酵前期的菌浓和pH对效价的预测，将此模型应用于生产实际，分别通过倒种和改变培养基中碳源组成的方法，使头孢菌素C的合成水平分别提高了118%和157%，表明模型具有较好的预测功能。
关键词： 头孢菌素C； 反向传播； 神经网络； 预测
Prediction of the cephalosporin C biosynthesis by a back propagation neural work model
ABSTRACT The back propagation (BP) neural work model was set up by cephalosporin C fermentation data, and the productivity was forecasted by PMV and pH changing tendency of early fermentation phase. The model was proved to be effective and with good prediction capacity. By increasing inoculum and changing medium carbon source, the productivity of cephalosporin C fermentation was further increased by 118% and 157%, respectively, which was well predicted by the established model.
KEY WORDS Cephalosporin C; Back propagation; Neural work model; Prediction
实现发酵生产过程的优化操作和控制，单凭经验或经典的试验数据是无法满足要求的，因此有必要建立模型指导发酵过程的优化，一些难于在线检测的重要变量、如菌体浓度，底物浓度和产物浓度等可借助于已建立的数学模型，通过测量与其相关的其它可在线测量的变量，如尾气中的氧和二氧化碳的含量、发酵液的温度、pH和溶氧浓度的变化等，得到在线的最优化估计。产黄头孢霉(Acremonium chrysogenum)生长与头孢菌素C合成的数学模型最早是由Matsumura提出来的，建立了头孢菌素C合成与形态分化，内源甲硫氨酸诱导头孢菌素C合成与葡萄糖代谢物阻遏效应的结构离散型(segregated)模型〔1〕。鉴于抗生素发酵难以建立精确的数学模型，无需精确模型的智能控制策略在抗生素发酵过程控制中得到了应用。基于误差反向传播(back propagation，BP)算法的多层前向神经网络(BP网络)已广泛用于发酵工业的培养基优化，连续搅拌反应器神经网络估计，分批发酵及补料分批发酵过程建模与控制优化〔2～5〕。Cruz等建立模型描述葡萄糖与蔗糖的利用速率与头孢菌素C的合成的关系，利用神经网络以早期的菌浓预测整个发酵过程的菌量〔6〕。Sliva等运用杂交神经网络，根据在线检测尾气中二氧化碳和氧的浓度，预测Cephalosporium acremonium发酵过程的菌体浓度，估计细胞的生长速率、底物的消耗速率和产物的生成速率〔7〕。李运锋等利用基于神经网络的滚动学习预报技术，实现了头孢菌素C产量、产物质量浓度和效益函数的超前预报，为发酵过程的动态控制和调度优化提供了支持〔7，8〕。 有关头孢菌素C的合成已建立了很多模型，而且用发酵早期的菌浓进行预测也已有研究， 但只用发酵早期的菌浓预测后期的菌量，并没有与产物合成关联起来。在头孢菌素C发酵过程放大的研究中，发现菌体早期的生长与产素的关系密切，因此本文采用BP神经网络技术利用发酵前期的大量数据建立效价的预估模型，实现了对头孢菌素C效价的预测，同时将该模型应用于生产实际。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种 产黄头孢霉(Acremonium chrysogenum)AC0508由山西威奇达药业集团提供。
1.1.2 培养基(%) 糊精50，玉米浆70，豆油10，DL蛋氨酸06，KH2PO4 04，(NH4)2SO4 08，FeSO47H2O 0005，CaCO3 10，消前pH62。
1.1.3 发酵罐 50L发酵罐的搅拌桨为六直叶(直径12cm)，三层，d/D=036，层间距12cm，搅拌桨叶尖线速度为1256～4082m/s；160m3发酵罐的搅拌桨四层，六直叶涡轮式搅拌桨，d/D=0375，搅拌桨叶尖线速度为518～848m/s。
1.2 试验方法
1.2.1 总糖和还原糖的测定 斐林试剂法〔9〕。
1.2.3 尾气分析 尾气分析使用VG Prima dB型质谱仪，最后的数据处理、通讯和相关分析通过华东理工大学国家生化工程技术研究中心自行开发的上位机软件包《发酵过程检测系统B10RADAR 2.0》完成〔10〕。
1.2.4 头孢菌素C效价测定方法 HPLC法。色谱柱为TSKgel ODS100S(46mm×250mm，10μm)；流动相20mmol/L乙酸铵缓冲液(pH56)∶乙腈(94∶6)，流速10ml/min，紫外检测波长254nm，室温，进样量20μl。
1.2.5 菌丝浓度测定 湿菌体(PMV)采用离心法计算，取10ml发酵液，3000r/min离心15min，计算固形物体积占发酵液的比例。
1.2.6 发酵培养方法 三级发酵。一级种子(种龄76h)→二级种子(种龄40h)→发酵，一级种子接入二级种子的接种量为10%，二级种子接入发酵的接种量为17%；通过压差法接入，发酵过程培养130～150h左右，培养温度40h之前28℃，40h后控制为25℃。发酵过程控制根据实验情况调整。补料用硫酸铵、豆油等各自分消，根据需要独立补入。
2 结果与分析
2.1 网络构建与模型检验在BP网络预估模型的建立中共选取23批发酵161组数据作为样本，其中18批发酵的126组数据作为学习样本，5批发酵的35组数据作为检验样本(Tab.1, Tab.2)。建立三层神经网络，三层网络的结构由输入层、隐层和输出层组成。由于固定了输入节点和输出节点的个数及各层数据处理函数，所以隐层节点数目将决定网络性能。在训练网络的过程中，为了获得最好的训练精度，依次选取1至20个隐层节点数。经过20000次训练后，得到其相应的误差平方和(Sum Squared Error，SSE)选取SSE最小的节点进一步训练，得到最优隐层节点的个数是2。然后对此BP网络再进行60万次训练，最终使其SSE达到00542，相对误差为419%。由此建立的BP网络结构(Fig.1)由6个输入节点、2个隐层节点、1个输出节点构成。6个输入节点(x1～x6)依次代表20、36、44、52h的菌浓(%)，发酵前期pH最高点与最低点的数值；输出节点y为60h效价(u/ml)。为检测上述建立的神经网络的预测能力，BP网络训练完成后，用剩余的五组数据(冗余数据)进行验证，所得验证结果如Tab.2所示，SSE为00077，相对误差分别为-07323%、15599%、-71026%、-55068%和-20026%。
Tab.1 （略）
Tab.2 （略）
2.2 模型应用通过神经网络模型预测，表明发酵前期菌浓与pH值的变化是决定效价的关键因素，前期菌浓较高，pH值变化幅度较大效价则较高。通过建立神经网络模型，能够利用发酵前期菌浓定量地预测效价，为进一步优化产素水平提供依据。任何能够引起前期菌浓与pH变化的因素都将影响到效价的高低，比如种子的质量、培养基的配比及其消毒温度、剪切环境、 培养温度等。
Fig.1 Topology of BP neural work（略）
发酵前期pH的变化反映了菌体的代谢活性，未加调控，因此实际操作上考虑从提高菌浓的角度来提高产素水平。
2.2.1 通过倒种增加接种量 增大接种量是提高菌浓的有效、快捷的方法，但由于种子罐的体积已定，无法通过加大种子培养液的体积来增大接种量，因此选择通过倒种增大接种量，在生产实践中检验模型的预测能力。将对照与倒种的罐批发酵前期的菌浓与pH的最高值和最低值输入模型，预测60h的效价，结果见Tab.3，相对误差为25687%和-93267%，通过倒种法60h效价比对照提高了353%，放罐时效价为33773u/ml，比对照提高了118%。