银杏滴丸对快速老化鼠超氧化物歧化酶影响(一)

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银杏具有重要药用价值，已知其化学提取物多达160余种。主要有黄酮类、萜类、酚类、生物碱、聚异戊烯、奎宁酸、亚油酸、蟒草酸、抗坏血酸、α-已烯醛、白果醇、白果酮等。其中成药制品可以防治高血压、心脑血管等疾病，对延缓衰老具有特殊的功效〔1,2〕。本文研究银杏滴丸对快速老化鼠超氧化物歧化酶(SOD)基因和蛋白表达的影响。现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1?1 样品 银杏滴丸为黑褐色小颗粒(某制药股份有限公司)。

　　1?2 试剂 聚赖氨酸(美国Sigma公司)；山羊抗大鼠SOD多克隆抗体（美国SANTA CRUZ公司)；丙二醛(MDA）测定试剂盒、SOD活性测定试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(中国TBD生物技术发展中心)。RT-PCR反应试剂盒(美国Promega公司)。免疫组化二抗试剂盒二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

　　1?3 仪器 DYY-38B型电泳槽(北京六一仪器厂)；日立20RP52D高速冷冻离心机；平推切片机(德国LEICA公司)；病理图象分析显微镜(日本Olympus公司)；恒温水浴震荡器(美国Lab Line公司)；GeneAmpゑPCR System 9700 PCR反应仪；Image MasterゑVDS Pharmacia Biotech光密度分析仪。
　　
　　1?4 动物与分组 采用6月龄快速老化鼠（SAM-P/8）。（天津市中医学院附属第一医院），3级(SPF)级实验动物房饲养。试验分快速老化鼠对照组和快速老化鼠干预组2组，每组10只，银杏滴丸人体推荐摄入量为0?60g／（60kg・bw）。根据预试验结果，选择受试剂量为0?05g/（kg・bw）即相当于人体摄入量的5倍。受试物用蒸馏水配制成溶液，对照组给予等量蒸馏水，经口灌胃2个月，灌胃量0?2ml／(10g・bw）。处理完成后迅速处死小鼠取肝组织测定以下指标。

　　1?5 SOD活性、MDA含量测定 将肝组织0?3g匀浆，3000r／min离心取上清测定。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，SOD活性测定采用黄嘌呤氧化法，按照试剂盒说明书。

　　1?6 免疫组化方法 用链霉卵白素抗生素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)对肝脏标本石蜡切片进行免疫组化染色，检测SOD蛋白在肝组织的表达。一抗为山羊抗小鼠SOD多克隆抗体，浓度均为1∶200，生物素化兔抗山羊二抗，以磷酸盐缓冲液（PBS）为一抗作阴性对照。细胞浆着棕黄色判定为阳性细胞。

　　1?7 RT-PCR方法 取肝组织采用改进的异硫氰酸胍酚-氯仿RNA快速提取法提取总RNA。260和280nm处测定RNA吸光度（A）值，评估纯度并计算其浓度。SOD上游引物5＇-ACTGCAGGATCATT-3＇，下游引物5＇-CAAGCGGCTTAGCATT-3＇，所扩增的小鼠Cu-Zn SOD特异性基因片断应为260bps。小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH)上游引物5＇-AACAGTATGATCAC-3＇，下游引物5＇-TAACTGTTGCTGTA-3＇，所扩增的小鼠GAPDH特异性基因片断应为452bp。RT-PCR按下列顺序加样：无核酸酶水26?4μl；AMV／Tf15×反应缓冲液10μl；dNTPMix(10mmol／Leach dNTP)1μl；上游引物50pmol；下游引物50pmol；25mmol／L MgSO4 2μl：AMV反转录酶1μl；Tfl DNA聚合酶1μl；RNA样品2μl；终体积50μl。试验条件为：42℃60min，94℃3min：变性94℃1min，退火60℃1min，延伸72℃1min，循环30次，72℃4min，4℃反应完成后，产物于-20℃保存；RT-PCR产物电泳检测、吸光度扫描分析。

　　1?8 统计分析 采用SPSS 11?0软件进行方差分析，对方差不齐的数据，适当变量转换后进行统计，变量转换后仍未达到方差齐，用非参数检验进行分析。

　　2 结果

　　2?1 银杏滴丸对小鼠MDA、SOD的影响(表1） 经口给予银杏滴丸后，快速老化鼠干预组肝匀浆中MDA含量低于其对照组，且差异有统计学意义(P0?05)，SOD活性高于对照组，且差异有统计学意义(P0?05)。

　　表1 银杏滴丸对快速老化鼠肝MDA、SOD的影响（略）

　　注：与对照组比较,*P0?05

　　2?2 银杏滴丸干预后快速老化鼠SOD基因表达与其对照小鼠比较(图1) 由图1可见，给予银杏滴丸干预后，快速老化鼠SOD mRNA的RT-PCR产物电泳条带亮度明显增强，表明银杏滴丸可以引起快速老化鼠SOD基因表达增加。