高产克拉维酸的耐甘油突变株选育及生理特性研究(一)
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作者：陈锡永 史毓芳 王普 杨美芬 郭子芬
【摘要】 以带小棒链霉菌XC-1-35为出发菌株，经紫外线照射60s，并结合甘油耐受性菌株的理性筛选，选育得到较佳诱变株XC-5-48，效价达1970μg/ml。该菌株经斜面连续传代4次，效价稳定在1800μg/ml以上。对该菌株的生理特性研究表明，其具有活力较强的甘油特异诱导的甘油转运系统(GTS)。以XC-5-48菌株为试验菌株，当培养基中甘油初始浓度为1.5%，并且在发酵60h时补加1.0%的甘油，摇瓶发酵的效价可达2668μg/ml，较出发菌株(318μg/ml)提高了7.4倍。该工艺应用于15L发酵罐共十个批次的发酵试验，96h时克拉维酸的平均效价达2103μg/ml。
【关键词】 克拉维酸； 生物合成； 甘油； 菌种选育； 菌种特性
ABSTRACT The clavulanic acid-producing strain Streptomyces clavuligerus XC-1-35 with the yield of 318 μg/ml was irradiated by UV for 60 s, and a glycerol-tolerant mutant XC-5-48 with a high productivity of 1,970 μg/ml was screened out. Physiological characteristics for strain XC-5-48 showed that this mutant not only had a stable productivity of clavulanic acid after subculturing for fourth generations, but also had active glycerol transport system (GTS) which was specifically induced by glycerol. Under the optimum concentration of 1.5% glycerol in fermentation medium and feeding of 1% glycerol as precursor after 60 h of incubation, the titer of 2,668 μg/ml was obtained in shake flask culture, an increase of 7.4 times pared with the original strain. Fermentation for 96 h in 15 L fermentor, the average yield reached to 2,103 μg/ml.
KEY WORDS Clavulanic acid; Biosynthesis; Glycerol; Breeding; Physiological characteristics
克拉维酸(clavulanic acid，CA)是由带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种β-内酰胺酶抑制剂〔1〕，虽然其自身的抗菌活性很低，但它可协同增强青霉素和头孢菌素对产生β-内酰胺酶的耐药菌的抗菌活性〔2〕，其与阿莫西林、替卡西林制成的合剂已在临床上广泛使用。近年来人们一直在致力于提高CA产量的研究〔3，4〕。
克拉维酸的β-内酰胺环上的碳骨架来自甘油的三个碳原子， 并且未经任何中间重新排列。 Minambres等〔5〕研究发现，生长在以甘油为唯一碳源的限定培养基中的带小棒链霉菌存在两种不同的转运甘油分子系统：其一是组成型的甘油转运系统；其二是由甘油特异性诱导的甘油转运系统(GTS)，透过细胞90%以上的甘油是由诱导的GTS转运的，其转运能力受到L-丝氨酸等物质的抑制。甘油缺乏时只能合成少量克拉维酸，却大量产生带小棒链霉菌的另一种代谢物头霉素〔6〕。甘油是生物合成克拉维酸所必需的物质，但当培养基中甘油含量超过110mmol/L时，克拉维酸的生物合成即受到抑制。李丹丹等〔7〕研究了带小棒链霉菌甘油耐受量与克拉维酸合成的关系，认为耐高甘油浓度的筛选方法可用于克拉维酸菌种的选育。孟勇等〔8〕以带小棒链霉菌RC11518(AT27064)为出发菌，采用物理和化学诱变剂处理，通过筛选抗终产物结构类似物舒巴坦钠突变株、底物甘油耐受性突变株、营养缺陷型突变株，获得一株克拉维酸高产突变株III50，摇瓶效价为834.8μg/ml。本文以带小棒链霉菌XC-1-35为出发菌进行紫外诱变，并结合理性化筛选，选育甘油耐受性突变株，改变菌株的生理特性，增强其GTS的活性，使之可高效转运甘油用于合成克拉维酸。同时，针对选育得到的甘油耐受性突变株，通过在发酵过程中补加甘油的方式，进一步提高克拉维酸的产量，取得了较好的研究结果。
1 材料与方法
(1)菌种 带小棒链霉菌(Streptomyces clavuli-gerus)XC-1-35，系浙江医药股份有限公司新昌制药厂保藏菌株。
(2)培养基及培养条件
斜面及平板培养 采用高氏1号培养基，28℃培养8～9d。
种子培养 250ml三角瓶装30ml培养基，置旋转式摇床28℃，220r/min振荡培养48h。培养基成分(g/L)：可溶性淀粉15，甘油15，鱼粉20，CaCO3 3，pH6.5～7.0。
摇瓶发酵 250ml三角瓶装30ml培养基，接种量10%，28℃，220r/min振荡培养96h。培养基成分(g/L)：淀粉50，甘油5，黄豆粉30，玉米浆5，CaCl2 0.1，NaCl 0.1，FeSO4・7H2O 0.1，MgCl2・6H2O 0.1，KH2PO4 0.8，CaCO3 3，pH6.5～7.0。
(3)分析方法
克拉维酸含量测定 发酵液采用6mol/L盐酸调pH至3.5～4.0，3500r/min离心10min，去除菌丝体和固体残渣，吸取5ml上清液，12000r/min离心10min后，用重蒸水适当稀释，供HPLC检测。色谱条件为：色谱柱C18，ODS(4.6mm×150mm)，柱温25℃。检测器：VWD(SPD-10A)，检测波长220nm，流动相：0.02mol KH2PO4∶乙腈(400∶12，体积比)，流速0.7ml/min，进样量10μl。
菌丝浓度测定 取10ml发酵液，4000r/min离心15min，测得沉淀物在发酵液中所占的比例即为菌丝浓度。
pH测定 pH电极测定。
(4)菌种诱变处理
单孢子悬液的制备 将冷冻孢子移种子斜面，培养成熟后加入500μg/ml的无菌咖啡因溶液(作助变剂)，刮下孢子并打散，用无菌滤纸过滤即得。
诱变处理 吸取5ml单孢子悬液于无菌平板中，置于功率为30W，波长253.7nm的紫外灯直下30cm处开盖振荡照射60s，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂平板，28℃，避光培养9d左右，挑取单菌落转接斜面。
(5)甘油耐受性突变株的筛选 将经紫外线照射的孢子悬液稀释后，分别涂布于含有一定甘油浓度的分离平板上，28℃培养9～12d。
2 结果与讨论
2.1 甘油耐受性突变株的筛选
带小棒链霉菌存在着甘油诱导的甘油转运系统(GTS)〔5〕，在甘油耐受性高的菌株中GTS活力强，可高效转运甘油合成克拉维酸〔7〕。为此，试验中采用耐受高浓度甘油的平板筛选UV诱变后的突变株。
(1)菌株XC-1-35对甘油的耐受性考察 分别将未诱变处理和经UV诱变处理后的XC-1-35菌株的单孢子悬液，采用梯度稀释后涂布于含不同浓度甘油的分离平板上，结果如表1所示。研究发现，未经处理的对照组在含12%以上甘油浓度的平板上无菌落生长，其甘油耐受浓度为10%；经UV诱变处理的诱变组在含14%甘油浓度的平板上还可生长出少量呈光秃型的小菌落，并且随着平板中甘油浓度的增加，菌落的生长速度也随之减慢，其培养时间由对照的9d延长到13d。
(2)甘油耐受性突变株的选育 将经UV诱变处理60s后的XC-1-35单孢子悬液适当稀释后涂布在含14%甘油浓度的分离平板上进行培养，筛选耐高甘油浓度突变株，共挑取了93支耐受菌株转接斜面。摇瓶发酵初筛及复筛结果表明，采用筛选甘油耐受性突变株的选育效果比较理想，正变率达到63.3%，负变率仅为3.3%。利用该抗性突变株筛选方法，试验中共进行了5轮的菌种选育，得到高产菌株XC-5-48的效价达1970μg/ml，为出发菌株(318μg/ml)的6.2倍。该诱变株经斜面连续传代4次，发酵效价稳定在1800μg/ml以上，表明其高产性能稳定，可用于进一步的试表1 对照组和诱变组的甘油耐受浓度比较验。
2.2 突变株XC-5-48与出发菌株XC-1-35的生理特性研究
Miuambres等〔5〕认为克拉维酸产生菌中具有两种不同的转运甘油分子系统。其中透过细胞90%以上的甘油是由甘油转运系统(GTS)转运的。GTS是一种分布于细胞膜上的透性酶(转运酶系)，酶活性的最适pH为7.0，最适温度为23～35℃，Km为14μmol/L，半衰期为8h左右。该透性酶的活性中心含有-SH基团，其转运能力与细胞膜结构的完整程度相关，并受到L-丝氨酸等某些物质的抑制。为此，试验中通过向发酵培养基中添加不同浓度的影响GTS系统活性的因素，如丝氨酸、碘乙酸、脂肪酸，分别观察其对突变株XC-5-48与出发菌株XC-1-35的生长代谢及产物合成的影响，以了解突变株的生理特性。