TNF?α?308位点基因多态性与环境因素在肝癌发生中的交互作用(一)

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作者：宋韶芳,郜艳晖,陈思东

【摘要】 　　目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF)α?308位点基因多态性与环境因素在肝癌发生中的交互作用。方法 应用1∶1配对病例对照的研究方法，对广东顺德地区81例原发性肝癌进行危险因素调查。用ELISA检测HBV感染5项指标、丙肝抗体、甲胎蛋白、肝吸虫抗体；PCR?RELP分析TNF?α?308位点。应用条件Logistic回归模型筛选出肝癌发生的环境及遗传危险因素。根据交互作用指标判断基因与环境的交互作用。结果 HBsAg、肝病史、饮酒、TNF2等位基因是广东顺德居民肝癌的危险因素。HBsAg与TNF2等位基因存在交互作用：其OR值为19.83(95%CI:4.20～93.61)；超相对危险比（RERI）、交互作用归因比（API）、两因素交互作用指数（SI）分别为14.39、0.73、4.23。肝病史与TNF2等位基因存在交互作用：其OR值为7.63(95%CI:1.05～67.71)；其RERI、API、SI分别为2.22、0.29、1.50。饮酒与TNF2等位基因存在交互作用：其OR值为4.57(95%CI:1.62～12.88)；其RERI、API、SI分别为1.39、0.30、1.63。结论 肝癌的发生是环境及遗传危险因素综合作用的结果，TNF2等位基因与HBsAg、饮酒、肝病史在肝癌发生中存在一定的交互作用。

【关键词】 原发性肝癌 肿瘤坏死因子α 基因多态 交互作用

　　Abstract:Objective To study the interaction of the environmental risk factors and the geic polymorphisms of the human tumor necrosis factor?α?308 position in primary liver cancer(PLC). Methods A case?control study was conducted in Shunde, Guangdong. Epidemiological data about environmental exposure of 81 cases and controls were collected, using ELISA to detect HBV, HCV, AFP, liver fluke and PCR?RELP technology to analyze TNF?α?308 position. Results Conditional logistic regression (CLR) was conducted to explore risk factors of PLC, and it is indicated that hepatitis B, alcohol consumption, liver disease history, and carriage of TNF2 allele were associated with increased risks of PLC．HBsAg was interacted with the TNF2 allele during the generation of PLC, with the OR=19.83 (95%CI:4.20-93.61); and their RERI, API, SI were 14.39, 0.73，and 4.23 respectively. Liver disease history was interacted with the TNF2 allele during the generation of PLC, with the OR=7.63 (95%CI:1.05-67.71), and RERI, API, SI were 2.22, 0.29，and 1.50 respectively. Alcohol consumption was interacted with the TNF2 allele during the generation of PLC, with the OR=4.57(95%CI:1.62-12.88), and RERI, API, SI were 1.39, 0.30，and 1.63 respectively. Conclusion The study indicated that risk factors of PLC, i.e, hepatitis B, alcohol consumption, liver disease history, and carriage of the TNF2 allele were associated with increased risks of PLC; and the TNF2 allele was interacted with HBsAg, liver disease history, and alcohol consumption.

　　Key words:primary liver cancer;human tumor necrosis factor?α;geic polymorphism;interaction effect

　　肝癌的发生受多种因素的影响，依其来源、性质与作用方式的差异，可分为外源性因素与内源性因素。在发达国家，丙肝病毒(HCV)和酗酒是肝癌的主要病因；而在发展中国家，乙肝病毒（HBV）是肝癌的主要病因，黄曲霉毒素、饮水污染等也起重要作用〔1〕。暴露于相同环境下的人群仅部分患肝癌，这表明遗传、免疫等内源性因素不同的个体患肝癌的几率不同。沈福民在1991年报告了对肝癌家系资料的分析结果，认为肝癌是一种具有主基因效应的因子遗传病〔2〕。
　　
　　肝癌患者多数有慢性炎症病史，当炎症慢性迁延，肝癌发生率明显增加，而用抗炎药物能延长晚期肝癌病人生存期。因此，慢性炎症是肝癌发生和发展的重要因素〔3〕，然而炎症与肝癌发生发展的分子机制仍然不清楚，国内外关于炎症因子之一肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）基因多态性和原发性肝癌关系的报道较少,并且结论不一致。

　　因此，本研究以我国肝癌高发区之一的广东顺德作为研究现场，采用1∶1配对的病例对照研究方法，探讨TNF?α?308基因多态性与环境因素在肝癌发生中的作用及交互作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　病例来源于广东顺德区各医院2004～2007年确诊并在该区居住＞10年的顺德籍原发性肝癌存活病人，共81例。对照按照1∶1配对方法收集未患肝癌81人，要求其在顺德居住＞10年，与病例同村、同性别,年龄与病例诊断年龄±3岁，无血缘关系。面访调查对象并填写调查表，取静脉血6～10 mL，-20 ℃低温保存。

　　1.2 问卷调查内容

　　年龄、性别等基本情况；吸烟、饮酒、食物摄入情况等生活习惯；肝病史、肝癌史等健康状况。主要变量的定义：肝病史：曾患脂肪肝、肝硬化、肝吸虫等肝脏疾病其中之一者。吸烟：每天吸烟1支以上，时间超过6个月。饮酒：每周饮酒1次以上，时间超过6个月。

　　1.3 实验室检测

　　1.3.1 血清学检测 用酶联免疫吸附试验(ELISA)(上海科华生物工程股份有限公司试剂盒)检测HBV感染5项指标、丙肝抗体、甲胎蛋白、肝吸虫抗体。

　　1.3.2 TNF?α?308位点基因型的检测

　　1.3.2.1 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTPs 、NcoI限制性内切酶、琼脂糖均为大连宝生物工程公司产品。蛋白酶K、EB购自上海生工生物工程公司。
　　
　　1.3.2.2 TNF?α的PCR扩增及酶切 高盐沉淀法提取基因组DNA〔4〕。20 μL PCR 反应体系含有:基因组DNA 2 μL，4 μmol/L 上下游引物各1 μL（上游 5＇?AGG CAA TAG GTT TTG AGG G AT?3＇，下游 5＇?T T CTG CTC CGA TTC CG?3＇），10×Buffer 2 μL，25 mmol/L的 MgCl2 1.2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 1.6 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/L) 1.25 μL,DMSO(3%)0.6 μL,灭菌双蒸水11.7 μL。扩增条件为94 ℃预变性2 min，然后94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，33个循环，最后于72 ℃总延伸5 min。酶切：取PCR产物10 μL,NcoI 1 μL,10×缓冲液2 μL,灭菌水5 μL置37 ℃水浴7 h。
　　
　　1.3.2.3 基因分型 取10 μL酶切产物加缓冲液1 μL，在3%琼脂糖凝胶90 V条件下泳动80 min,于紫外灯下观察TNF?α三种基因型。基因型为TNF1/1纯合子时扩增的片段含NcoI酶切位点，可被完全酶切为87 bp、20 bp两条带；TNF1/2杂合子时，产生不完全酶切出现107 bp、87 bp、20 bp三条带；TNF2/2纯合子时，其PCR产物经NcoI消化，不产生酶切，电泳后只出现107 bp一条带。见图1。

　　M：DL200DNA分子量标记物； 1,5：TNF1/1基因型； 2,4：TNF1/2基因型； 3：TNF2/2基因型

　　图1 TNF?α?308位点基因型电泳结果（略）

　　Figure 1 Electrophoresis plot of TNF?α?308 genotype

　　1.4 数据统计与分析

　　利用EpiData建立数据库，使用SPSS12.0进行统计分析。

　　1.4.1 计算TNF2等位基因频率，按Hardy?Weinberg平衡原理确认样本的群体代表性。

　　1.4.2 将单因素分析中有统计学意义的变量引入多因素条件Logistic回归模型，通过向前逐步回归方法，以0.05作为选入变量和以0.10作为剔除变量的显著水平，进行多因素条件Logistic回归分析。求出OR值、OR值95%可信区间及P值。

　　1.4.3 交互作用评价指标

　　指标1 超相对危险比(RERI)=OR（AB）-〔OR（B）+OR（APERIOR（AB）=OR（AB）-〔OR（B）+OR（AOR（AB）

　　评价因素A,B同时存在时，疾病中可以归因于两因素交互作用的比例。

　　指标3 两因素交互作用指数(SI)=OR（AB）-1〔OR（B）-1〕+〔OR（A）-1〕

　　当SI=1时，无交互作用；SI＞1时，为正交互作用；SI＜1，为负交互作用。

　　2 结果

　　2.1 一般情况

　　共调查病例对照81对，采集血样78对，其中男性70对，占89.74%，女性8对，占10.26%。病例组诊断年龄在33～83岁，平均诊断年龄为（57.86±12.06）岁。对照组年龄在30～83岁，平均年龄为（57.65±11.69）岁。

　　2.2 吻合度测验

　　结果显示，对照组TNF?α?308位点的基因型频率符合Hardy?Weinberg比例，表明对照组具有良好的代表性(表1)。

　　表1 对照组基因型频率的吻合度检验（略）

　　Table 1 parison of genotype frequency distributions of control group

　　χ2=0.54, P＞0.05

　　2.3 原发性肝癌危险因素条件Logistic回归分析

　　2.3.1 原发性肝癌危险因素条件Logistic模型单因素分析 以是否患肝癌为因变量，以吸烟、饮酒、肝病史、HBsAg等26个变量为自变量进行单因素分析，结果显示饮酒、肝病史、HBsAg、抗?HBs、抗?HBe、抗?HBc、TNF2有统计学意义（表2）。

　　表2 原发性肝癌危险因素条件Logistic模型单因素分析结果（略）

　　Table 2 Single?factor logistic regression analysis for risk factors of PLC