牙髓培养细胞体外诱导矿化能力：冠髓与根髓的比较(一)

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【摘要】 目的 比较人牙髓的根、冠髓培养细胞体外诱导矿化能力，探讨牙髓干细胞在牙髓中的定位。方法 用组织块法对人牙的根髓和冠髓细胞进行原代和传代培养，将第五代培养细胞用条件培养液（20％DMEM＋10nmol/L地塞米松＋10mmol/L β-甘油酸钠＋50mg/L L-抗坏血酸）诱导矿化，在诱导后第10、20、30天对细胞进行Von Kossa钙染色。结果 根髓中形成的矿化小结比冠髓中更早、更强烈。结论 根髓比冠髓更容易诱导矿化。牙髓干细胞可能存在于根髓和冠髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度。

【关键词】 牙髓干细胞；细胞培养；矿化结节

The induced mineralization ability in cultured dental pulp cells:the paration between coronal and root pulp cells

【Abstract】 Objective To pare the mineralization ability between cultured dental root and coronal pulp cells,and to investigate the localization of dental pulp stem cells(DPSCs) in dental pulps. Methods The human dental root and coronal pulp cells were cultured in tissue-explant method,the 5thgeneration of cells were subcultured with conditioning medium(20%DMEM+10nmol/L +dexamethasone+50mg/L ascorbic acid) to induce mineralization. At the days of 10,20,30 after inducing,von Kossa for calcium staining was used to investigate the mineralization ability in root and coronal pulp cells. Results The mineralization nodules appeared earlier and stronger in the root pulp cells than that in the coronal pulp cells observed in phase-contrast microscope and von Kossa staining. Conclusion Root dental pulp cells could be induced to mineralization more easily than the coronal pulp cells . DPSCs may exist in both root and coronal pulp, and its density in the root pulp is higher than that in coronal pulp.

【Key words】 dental pulp stem cells；cell culture；mineralization nodules

牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）在成体牙髓腔中的定位问题是牙体组织工程学中尚未解决的基本问题。研究表明，体外培养的DPSCs和骨髓干细胞一样，都具有在一定条件下诱导矿化形成矿化小结的能力，矿化小结的形成是DPSCs分化的标记。本文通过对体外培养的人牙髓髓细胞诱导矿化，并对其矿化能力进行比较，以探讨DPSCs在牙髓中的定位。

1 材料与方法

1.1 主要实验器材及试剂 CO2培养箱（Nuaire, America）；超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；相差显微镜（Olympus, Japan ）；细胞培养瓶及培养板（Costar, America）；高速离心机（上海医用设备厂）；细胞记数板；高糖DMEM培养基（Gibco, USA）；胎牛血清（Hyclone公司）；地塞米松（Sigma, USA）；L-抗坏血酸（Amesco, USA）；β-甘油磷酸钠（E.Merck, Darmstadt）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 收集5颗16～25岁健康人因正畸或阻生而拔出的第三磨牙，在无菌条件下分别取其根髓和冠髓，用组织块法进行细胞原代和传代培养〔1〕，培养液为DMEM。

1.2.2 细胞染色 分别将生长状态良好的冠髓和根髓细胞接种于有盖玻片的6孔板上，当细胞汇合约60%～70%时，改用条件培养液（加入10nmol/ L地塞米松＋10mmol/ L β-甘油酸钠＋50mg/L L-维生素C），连续培养30天。在倒置相差显微镜下观察矿化结节形成情况。分别于10、20、30天时，取出盖玻片，按Von Kossa法进行染色。染色方法如下：（1）取出长有细胞的盖片，PBS冲洗3遍，FAA固定液（80%乙醇9ml，冰醋酸0.5ml，中性福尔马林0.5ml）中固定30min。（2）蒸馏水冲洗3次。（3）固定后的细胞加入5%的硝酸银溶液，良好日光下染色1h，蒸馏水冲洗，5%的硫代硫酸钠作用1～2min，再用蒸馏水洗5min，干后封片，或伊红复染，常规脱水后封片。

结果判断：矿化结节被染成深黑色。

1.3 对照设计 体外培养的牙周韧带细胞具有较强的钙化能力，用作Von Kossa钙染色的阳性对照片。

2 结果

2.1 相差显微镜下观察 在矿化培养2天时，根髓细胞出现融合现象，细胞间隔消失，冠髓细胞无明显变化；矿化培养10天时，根髓细胞呈局灶性复层生长，呈网状或束状排列；15天时，根髓复层中央部分细胞进一步密集，形成细胞结节，冠髓细胞开始出现复层生长；矿化培养20天时，根髓细胞结节中央出现黑色高密度物质沉积，并且随着时间延长增多，冠髓细胞结节中央开始出现少量褐色沉积物；矿化30天时，根髓出现明显的黑色矿化结节，冠髓中有小而少的矿化结节出现。

2.2 Von Kossa法钙盐染色

2.2.1 根髓细胞 于诱导培养20天时，在细胞结节中央出现被染成黑褐色的小块，表明钙质沉积。诱导培养30天时，黑色小块进一步增大(见图1略)。

2.2.2 冠髓细胞 20天时，尚无染色阳性矿化结节形成。30天时，少数区域出现矿化结节，体积较小且强度微弱(见图2略)。

2.2.3 阳性对照片 相同染色条件下体外培养的牙周韧带细胞出现黑色团块（见图3）。（本文图片见封三略）

3 讨论

本实验发现体外持续培养的牙髓细胞在诱导剂作用下经历了融合期、复层生长期、细胞结节形成期而最后发生矿化，这与Tsukamoto等〔2〕的观察相一致。研究发现，体外培养的牙髓细胞能复层生长，在一定条件下能分泌形成类牙本质样的矿化结节〔3〕。结节中细胞是处在分化中的成牙本质细胞前期,体外培养单层生长的细胞不具有形成矿化基质的能力而牙髓细胞复层生长可以形成细胞结节，细胞结节所具有的三维结构是形成钙化的先决条件〔4〕。