反义寡核苷酸抑制survivin表达来增强乳腺癌细胞株MCF?7和MDA?MB?231对多西他赛敏感性的研究(一)

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【摘要】 目的： 探讨利用反义寡核甘酸（ASODN）技术封闭乳腺癌细胞株survivin基因,观察survivin基因表达下调能否诱导细胞凋亡及增强对多西他赛(docetaxel)药物敏感性。方法： Survivin ASODN单独及联合多西他赛处理乳腺癌细胞株MCF?7和MDA?MB?231,RT?PCR检测survivin mRNA的表达,免疫细胞化学方法和Western blotting检测survivin蛋白表达,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞的生长抑制率。结果： Survivin ASODN可下调人乳腺癌细胞株中survivin mRNA 和蛋白质的表达；survivin ASODN 与多西他赛联合用药组相比对照组和多西他赛组可明显抑制细胞株的生长（P0.01)。结论： Survivin ASODN明显抑制survivin基因在乳腺癌细胞株MCF?7和MDA?MB?231中的转录及翻译,明显提高乳腺癌对多西他赛的敏感性。

【关键词】 生存素； 反义寡核苷酸； 多西他赛； 乳腺癌细胞株

生存素（survivin）作为凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成员之一,具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重作用〔1〕。 Survivin基因在几乎所有恶性肿瘤组织中出现高表达,而在正常成人组织中不表达(胸腺、胎盘、子宫内膜除外)〔2〕,survivin蛋白与日渐增多的乳腺癌的发生、发展及预后密切相关〔3〕,这种选择性表达使之成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的研究热点。多西他赛是目前治疗转移性乳腺癌单药有效率最高的药物,尽管如此,多西他赛单药的有效率也只在40%～68%〔4〕,而且对复发和多处转移的患者易出现化疗耐药。本研究旨在探讨利用反义寡核苷酸（ASODN）封闭survivin基因的表达是否能增加乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性,为临床提高乳腺癌化疗敏感性提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF?7和MDA?MB?231细胞株由蚌埠医学院实验中心提供；LipofectamiM2000购于Invitrogen公司；G418购自Sigma公司；总RNA提取试剂盒及GAPDH购于TaKaRa公司；兔抗人多克隆抗体survivin购于Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体购于北京中杉金桥；ECL发光试剂盒购自Pierce公司；多西他赛（Aventis Pharma Dagenham公司产品）溶解于二甲亚砜（DMSO,GIBCO公司产品）,4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸的设计及合成 Survivin ASODN是针对survivin mRNA的编码序列设计（参照文献〔5〕）,序列为5＇?c agc ctt a gct t tg?3＇（第232?251）。无义寡核苷酸（NSODN）作为反义序列的对照,自行设计序列为5＇?gca t agt ctc t ?3＇,经基因库BLAST比对,未发现同源序列。以上反义寡核苷酸均采用逐步硫代修饰,委托上海生工生物工程有限公司代为合成。使用时用无小牛血清的RPMI 1640培养液溶解。

1.2.2 脂质体介导survivin ASODN转染MDA?MB?231细胞 取对数生长期MDA?MB?231细胞计数并调整细胞浓度为2×105ml-1,接种于6孔培养板中；24h后,当细胞达到60％～80％融合贴壁时取两试管。A管：加10μl Lipofectin,以无小牛血清的RPMI 1640培养液补充至100μl；B管：分为对照、Lipofectin、NSODN（300 nmol・ L-1）、浓度不等的ASODN(终浓度分别为100、300、500 nmol・L-1),以无小牛血清的RPMI 1640培养液补充至100μl。将两试管中的液体轻轻混合摇匀孵育,洗涤后换液培养,根据实验要求培养24～48h后收取细胞进行检测。

1.2.3 RT?PCR检测survivin mRNA的表达 分别收集各组细胞，Trizol试剂提取总RNA,RT?PCR扩增survivin mRNA并进行比较;引物根据GenBank报道的survivin基因序列（no.NM_001168）设计。Survivin基因（134bp）上游引物为5＇?gga a g cat ctc tac att c?3＇,下游引物为5＇?aga aga aac act ggg a agt c?3＇；β?actin（275bp） 上游引物为5＇?gct cac cat gga tga tga tat c?3＇,下游引物为5＇?g aga ttt tct a tgt cgt c?3＇。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳,观察结果并拍照。

1.2.4 免疫细胞化学法检测survivin蛋白的表达 分为阴性对照（PBS代替一抗）组、对照组、300nmol・L-1NSODN组和300 nmol・L-1survivin ASODN组。取1×105ml-1MDA?MB?231细胞,6孔板爬片,每孔加细胞悬液2ml,待70％～80％汇片后弃培养液,按转染步骤转染,5～6h后换含10％小牛血清的培养液继续培养48h后检测。免疫细胞化学方法检测按试剂盒操作步骤。镜下观察survivin蛋白表达的情况,胞浆呈黄色或棕黄色为阳性。

1.2.5 Western blotting检测survivin蛋白的表达 分为对照组、300 nmol・L-1 NSODN组和300 nmol・L-1survivin ASODN 组，作用于MCF?7细胞。收集各组细胞(5×106),用细胞裂解液提总蛋白,进行SDS?PAGE凝胶电泳后将蛋白质转移至PVDF膜上。封闭后依次加入一抗（兔抗人survivin多抗）和二抗（羊抗兔辣根过氧化物酶）,TBST漂洗后暗室曝光摄影。

1.2.6 Survivin ASODN与多西他赛联用或单用对细胞的影响 取对数生长期MCF?7细胞,以每孔1×105接种于96孔板。分为对照组、 Lipofectin组、 100 nmol・L-1 ASODN组、 300 nmol・L-1 ASODN 组、 500 nmol・L-1ASODN组、 20mg・L-1多西他赛组和 300 nmol・L-1ASODN +20mg・L-1多西他赛组。培养48h后镜下观察。

1.2.7 乳腺癌细胞对多西他赛敏感性的分析 取对数生长期MCF?7细胞,以每孔1×105接种于96孔板。分为对照组、 Lipofectin组、 300 nmol・L-1NSODN组、 300nmol・L-1ASODN 组、 多西他赛组、300nmol・L-1ASODN+多西他赛组、 300nmol・L-1NSODN+多西他赛组、 Lipofectin+多西他赛组（上述各组多西他赛质量浓度均为20 mg・L-1）,每组设3个复孔。48h换液时加入多西他赛至设定浓度,再继续培养48h中止。上述各组培养中止前加入10mg・ml-1 MTT液,同样条件下培养4h后吸出培养液,加入200μl DMSO振荡溶解,空白对照调零,酶标仪检测吸光值,测定波长为570nm。抑制率＝（空白对照组值-实验组值）/空白对照组值×100％。比较各组对乳腺癌细胞生长抑制的影响。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.5软件处理,数据以x-±s表示,两因素分析使用两因素析因设计的方差分析,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Survivin ASODN对survivin mRNA表达的抑制作用 对照组、Lipofectin组和无义寡核苷酸组survivin mRNA表达较强,组间无明显差别；100 nmol・l-1survivin ASODN组表达较弱,300 nmol・L-1和500 nmol・L-1浓度组均无表达（图1）。随着时间的延长survivin mRNA表达减弱（图2）。因此,survivin ASODN对survivin mRNA的抑制作用有浓度和时间依赖性。1.Marker； 2.对照组； 3.Lipofectin组； 4.NSODN 300 nmol・L-1组； 5.Survivin ASODN 100 nmol・L-1组； 6.Survivin ASODN 300 nmol・L-1组； 7.Survivin ASODN 500 nmol・L-1组； 8.Marker图1 Survivin ASODN对MDA?MB?231细胞

2.2 Survivin ASODN下调MDA?MB?231细胞内survivin蛋白的表达 MDA?MB?231细胞内 survivin蛋白阳性结果呈胞浆染色棕黄色细颗粒状（图3A、B）；以PBS代替一抗的阴性对照细胞,细胞核呈深蓝色,胞浆透明,无棕色颗粒(图3D)。结果表明survivin蛋白的活性能被survivin ASODN抑制(图3C)。A.对照; B.NSODN; C.Survivin ASODN; D.阴性对照

2.3 Survivin ASODN下调MCF?7细胞内survivin蛋白的表达 由图4可知survivin蛋白的表达能被survivin ASODN抑制，而NSODN组与对照组相比无明显变化。