三七总皂苷对快速老化小鼠SAMP8大脑β-淀粉样蛋白前体蛋白表达的影响(一)

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作者：钟振国 吴登攀 王进声 张雯艳 吕良 屈泽强

【摘要】 目的探讨三七总皂苷（PNS）对快速老化小鼠SAMP8β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)表达的影响。方法采用免疫组织化学方法，在高倍显微镜下随机选取小鼠大脑顶叶皮层和海马周围白质连续五个视野，并计数五个视野APP免疫阳性细胞平均个数。结果PNS能明显减少快速老化小鼠大脑APP阳性细胞数量。结论PNS对SAMP8 APP的表达有明显抑制作用。

【关键词】 三七总皂苷 快速老化小鼠 β-淀粉样蛋白前体蛋白 免疫组织化学

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）又称老年性痴呆，是一种原发性大脑神经退行性病变，为特有的中枢胆碱能神经元的大量死亡及丢失，伴有神经炎斑、神经纤维缠结的形成，并有含β折片结构的淀粉样蛋白（Amyliod-protein, Aβ）沉积〔1〕。Aβ沉积导致胆碱能神经细胞的损害，胆碱乙酰基转移酶（Choline Acetyltransferase, ChAT）水平下降和乙酰胆碱（Acetyl choline, Ach）递质合成的降低〔2〕。Ach在学习、记忆和活动中发挥重要作用。因而，治疗本病的关键是寻找能降低Aβ生成和沉积的药物。

三七为五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen 的根，传统中医理论认为其性味甘、微苦、温，归肝胃经，具有化淤、止血、活血定痛之效。现代药理研究表明，三七对心血管系统、血液系统、免疫系统、神经系统等均有不同程度的药理作用，而对神经系统损害的保护作用尤为引人注目。此前的研究已表明，三七总皂苷(total saponins of Panax notoginseng, PNS)对以d-半乳糖腹腔注射致亚急性损伤合并鹅膏蕈氨酸(Ibotenic acid，IBA)损毁双侧大脑Meynert基底核建立的AD大鼠动物模型引起的胆碱能神经元损害具有保护作用〔3〕，这些作用是否通过减少Aβ的生成和沉积仍然是不清楚的。β-淀粉样蛋白前体蛋白(Amyliod β-protein precursor,APP)则与Aβ的形成量相关。为此，本研究应用免疫组织化学的方法在快速老化小鼠SAMP8模型评价了三七总皂苷（PNS）对β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP)表达的影响。

1 材料

1.1 试剂多聚甲醛（polyoxymethylene）;PBS 缓冲液（0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.6）;蔗糖缓冲液（10％，20％，30％蔗糖缓冲液，0.1 PB, pH＝7.2～7.4）;Aβ1－40多克隆抗体：CHEMICON公司（批号：0507005616）；Aβ1－42多克隆抗体：CHEMICON公司（批号：0507003468）；APP多克隆抗体：CHEMICON公司（批号：25041098）；Max Vision试剂盒：福州迈新生物技术开发公司（批号：20061005）。

1.2 试药PNS由云南玉溪维和制药厂生产（批号：20050701）；石杉碱甲组（双益平片）由浙江震元制药有限公司生产（产品批号：040801）。

1.3 动物快速老化小鼠SAMP8（以下简称小鼠）70只，体重20～30 g。由天津中医药大学提供（合格证号：W－J津实动质M准字第006号）。

2 方法

2.1 动物分组及给药将购买的小鼠随机分为空白对照组（以下简称空白组）、PNS高剂量组（以下简称高剂量组）、PNS低剂量组（以下简称低剂量组）、石杉碱甲组（阳性对照组，以下简称阳性组），每组30只，另留10只（模型对照组，以下简称模型组）在给药前进行检测记忆、行为，以与用药后进行对照分析用，同时也用于检验模型是否成功。

动物适应性喂养2周后给药，以双蒸馏水调配后灌胃给药。PNS高剂量按93.5 mg/kg给药，PNS低剂量按23.38 mg/kg给药（参照临床成人用量：每天360 mg/70 kg）；阳性对照药石杉碱甲按0.0386 mg/kg给药（参照临床成人用量：每天0.3 mg/70 kg）；空白对照组给与给药组相同容积的双蒸馏水灌胃。1次/d，连续给药两个月。

2.2 免疫组织化学染色方法 快速开胸，经左心室插管，80 ml冷生理盐水冲洗后，100 ml含4％多聚甲醛PBS液灌注固定。灌注固定后，除去颅盖，取出完整大脑组织，脑组织块在上述固定液里固定4 h后，依次放入10％，20％，30％的蔗糖缓冲液（0.1 PB，pH＝7.2～7.4）中，4℃冰箱冷藏；脑组织石蜡包埋，沿针道层面附近连续冠状切片，片厚5 μm,。切片常规脱蜡水化，用PBS洗5 min×3次。切片加50μl过氧化酶阻断溶液，室温下孵育15 min， PBS洗5min×3次，用50μl 正常非免疫血清室温孵育10 min后加入50 μl 第1抗体(1：1 000)， 4℃孵育过夜。PBS洗5min×3次后加入50μl生物素标记的第2抗体，室温下孵育10 min。PBS洗5 min×3次。用50μl链霉菌抗生物素－过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min。PBS洗5min×3次。加100 μl新鲜配制DAB溶液，呈色3～10 min。自来水冲洗后用苏木素复染3～5 min。自来水洗至返蓝。常规脱水、透明，中性树胶封片。

2.3 评价指标与统计学分析应用显微镜观察，在高倍镜下（40×）随机选取小鼠大脑顶叶皮层、海马周围白质连续5个视野，并计数5个视野APP免疫阳性细胞平均个数。结果以SPSS 11.5 for Windows 统计软件进行统计学处理，各组间差异采用单因素方差分析，同时进行Levene方差齐性检验，方差齐性资料采用F检验，各组间差异采用LSD法或SNK法比较；方差不齐资料采用近似F检验Welch或Brown-Forsythe法，并且各组间采用Dunt's T3或Dunt's C法比较。方差齐性检验水平取α=0.05，方差检验显著性水平取α＝0.05。