氯离子对东方拟无枝酸菌发酵产物的影响(一)
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作者：周雨朦 洪文荣 阮林高 陈代杰 戈梅
【摘要】 本文研究了氯离子对东方拟无枝酸菌发酵产物的影响。在常规培养条件下，改变发酵培养基中氯离子存在形式或是添加抑氯剂和溴化钠，都发现了新组分无氯万古霉素(didechlorovanycin，DDCV)的产生。通过对培养基中添加抑氯剂的量的改变，发现加入0.005% 2?巯基苯骈噻唑和0.1%溴化钠时万古霉素产量降至对照的6%，而DDCV的相对含量达到62%。
【关键词】 无氯万古霉素； 抑氯剂； 溴化钠
ABSTRACT This study focused on the effect of chorine on the fermentation products of Amycolatopsis orientalis. Changing the form of inanic salt of Chloride anion or adding its inhibitor and NaBr into the medium, a new ponent――didechlorovanycin (DDCV) was found. An optimum fermentation medium was obtained in which 0.005% inhibitor and 0.1% NaBr was added, while the vanycin yield decreased to 6%, and the relative content of didechlorovanycin was reached up to 62% as pared to the control respec?tively.
KEY WORDS Didechlorovanycin (DDCV); Inhibitor of Cl; Sodium bromide
收稿日期：2007?09?03 修回日期：2007?11?27
作者简介：周雨朦，女，生于1982年，在读硕士研究生。 * 通讯作者，E?mail:hongwr56@tom. 万古霉素(vanycin)是由东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)发酵产生的一种糖肽类抗生素〔1〕，是目前临床上用于治疗耐甲氧西林金葡菌(MRSA)引起的严重感染的重要药物〔2〕。但是，随着耐万古霉素的金葡菌(VRSA)和肠球菌(VRE)的出现，导致临床上治疗感染性疾病又出现了新的棘手问题，严重威胁着人类的生命健康。我们从研究万古霉素的结构类似物入手，寻找新的对耐药菌更有效的药物。
在研究万古霉素组分的过程中，在某培养基的发酵产物中发现了一个含量较低的未知组分，针对该组分进行研究，最终确定此组分为无氯万古霉素(didechlorovanycin，DDCV)。在发酵优化方面，借鉴工业上生产四环素的方法， 在培养基中添加抑氯剂和氯的竞争性抑制剂，可获得较高产量的无氯万古霉素。
1 材料与方法
1.1 菌株
东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)HB10007(上海来益生物药物研发中心保藏)。
1.2 试剂和仪器
本实验所用试剂纯度均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。HPLC型号：Agilent 1100 Series公司；MS型号：Q?TOF micro (Waters公司)。
1.3 培养基
(1)斜面培养基 高氏一号合成培养基。
(2)种子培养基(%) 可溶性淀粉4.0， 黄豆粉2.0，葡萄糖1.5，硝酸钾1.5，磷酸二氢钾0.02，硫酸镁0.02；消前pH6.8。
(3)发酵培养基(%，自来水配制) 甘油6.0，硝酸钾1.5，磷酸二氢钾0.03，氯化镁0.06，碳酸钙0.3；消前pH6.2。
1.4 培养条件
(1)斜面培养条件 培养温度28℃，相对湿度40%～60%，培养5d。
(2)种子摇瓶培养条件 培养温度28℃，相对湿度40%～60%，装量25ml/250ml三角瓶，摇床转速220r/min，培养48h。
(3)发酵摇瓶培养条件 培养温度28℃，相对湿度40%～60%，装量25ml/250ml三角瓶，摇床转速220r/min，接种量8%，培养120h。
1.5 无氯发酵实验、组分取代实验和抑氯剂添加试验
(1)无氯发酵实验 以发酵培养基作为对照，用去离子水配制发酵培养基，考察以等量的硫酸镁取代氯化镁对万古霉素及其他组分合成的影响。培养条件同1.4。
(2)组分取代试验 以发酵培养基作为对照，用去离子水配制发酵培养基，分别考察以等量的硫酸镁、氯化钠、氟化钠、溴化钠代替氯化镁对万古霉素及其他组分合成的影响。培养条件同1.4。
(3)抑氯剂添加试验 以发酵培养基作对照，然后在对照培养基中加入不同浓度的2?巯基苯骈噻唑和溴化钠，考察添加物对发酵结果的影响。培养条件同1.4。
1.6 发酵组分和效价测定
发酵液中万古霉素及其相关产物的含量分析参照2000版《美国药典/国家处方集》(USP24/NF19)中万古霉素的HPLC分析方法进行。