OXA?50型碳青霉烯酶基因在铜绿假单胞菌中分布的初步研究(一)

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作者：刘梅 杜宝中 曾蔚 程曦 陶传敏 康梅 贾文祥

【摘要】 目的 研究铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制。方法 收集非重复34株铜绿假单胞菌临床株，PCR扩增blaOXA?50基因、测序、在GenBank上比对、提取质粒DNA、对该基因进行PCR扩增。结果 PCR检测出34株铜绿假单胞菌中有15株含OXA?50型基因，其中30株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中有12株阳性，4株敏感菌中亦有3株阳性；随机选取1株阳性菌PCR产物送测序，测序结果在GenBank上进行blast比对，显示有两个突变点；blaOXA?50基因扩增阳性的15株铜绿假单胞菌，提取质粒DNA扩增该基因，结果为阴性。结论 本次实验检测了34株铜绿假单胞菌临床株，OXA?50型基因的检出率为44.10%，其中1株发现有两个位点突变；检测到的blaOXA?50编码基因位于染色体上。

【关键词】 铜绿假单胞菌； OXA?50型基因； 碳青霉烯类抗生素

ABSTRACT Objective To study the distribution of OXA?50 gene in Pseudomonas aeruginosa. Methods A total of 34 isolated clinical strains of Pseudomonas aeruginosa were subjected to PCR analysis with primers specific for blaOXA?50, which was used for paring the sequence results with corresponding sequences in GeneBank, then plasmid DNA of positive strains for PCR was extracted. Results 15 isolated strains showed positive results for blaOXA?50 detection, 12 strains were identified in carbapenems?resistant Pseudomonas aeruginosas, and 3 strains were detected in carbapenems?sensitive Pseudomonas aeruginosa; the sequencing result of one positive strain showed that there were two mutational sites, and the PCR for plasmid DNA of all positive strains were negative. Conclusions In this experiment, the detection rate of blaOXA?50 was 44.10%, there were two mutational sites in one of positive strains, and all the blaOXA?50 were located in chromosome.

KEY WORDS Pseudomonas aeruginosa; blaOXA?50; Carbapenems

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)属革兰阴性杆菌，可引起菌血症、肺炎、泌尿系感染、烧伤感染和囊性纤维化继发感染等疾病，尤其易感染免疫力低下的患者。由于其耐药株不断产生〔1～3〕，耐药性不断变化，已成为医院内获得性感染最严重的条件致病菌之一。碳青霉烯类抗生素是一类广谱、高效的抗生素，除分枝杆菌、细胞壁缺损的细菌及一些极罕见的非发酵菌和气单胞菌外，它几乎对所有致病性细菌都有效，目前国内应用的碳青霉烯类抗生素以亚胺培南、美罗培南为主。然而，随着碳青霉烯类的广泛应用，细菌对其敏感性逐年下降，耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌也在不断增多。据文献报道〔4～6〕，铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率从2001年的5.3%上升到2006年的34.4%。华西医院2005年1月～7月铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率达54.23%〔7〕。尽管每篇文献中报道的耐药率不同，但从总体上看铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率有逐年升高的趋势，导致对其耐药机制的研究日趋重要。目前为止，铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗生素的机制主要有：外膜孔蛋白的丢失、外排泵系统上调以及水解酶(碳青霉烯酶)的产生。本实验主要研究blaOXA?50编码基因在铜绿假单胞菌中的分布情况。

1 料与方法

1.1 材料

(1)菌株来源和菌种鉴定 2004年1月～2005年3月期间从四川大学华西医院分离的34株非重复铜绿假单胞菌临床株以及1株耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌(作为PCR阴性对照)，所有菌株均来源于痰和创面分泌物标本。细菌鉴定按照全国临床检验操作规程常规操作，全部使用MicroScan WalkAway?40全自动微生物鉴定系统，标准质控菌株为大肠埃希菌AT25922和铜绿假单胞菌AT27853(均为本教研室保存)。

(2)试剂 抗生素粉剂均购自华北制药集团股份有限公司，包括：亚胺培南(imipenem，IMP)、环丙沙星(ciprofloxacin，CPLX)、头孢他啶(ceftazidime，CAZ)、哌拉西林(piperacillin，PIPC)和阿米卡星(amikacin，AMK)；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京天为时代公司；PCR相关试剂购自广州东盛生物科技有限公司。

1.2 药物敏感实验

采用MicroScan快速接种法，直接挑取菌落充分混匀于生理盐水，倾注于配套Negative boPanel Type21鉴定药敏板(NC21测试板)，进行体外药敏测定，实验中每批次的鉴定药敏板均用大肠埃希菌AT25922和铜绿假单胞菌AT27853进行质控。同时采用CLSI/NLS推荐的琼脂对倍稀释法进行5种药物各15个浓度的体外药敏测定MIC值，以铜绿假单胞菌AT27853进行质控，按照CLSL/NLS(2004年)规定判断结果。

1.3 细菌DNA的提取

采用北京天为时代公司的细菌基因组DNA提取试剂盒制备细菌模板DNA，提取的DNA经A260/A280测定符合质量标准，置-20℃冰箱保存待用。