龟鹿益髓胶囊对实验性脑脊髓炎发病情况、T淋巴细胞增殖及细胞因子的影响(一)

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作者：张志慧 陈金亮 王殿华

【摘要】 　　目的观察中药龟鹿益髓胶囊对实验性脑脊髓炎的发病情况、脾T淋巴细胞增殖、血中IL?2，IL?4，IL?6，TNF?α的影响。方法该实验采用豚鼠脊髓匀浆和完全福氏佐剂制成的抗原-佐剂乳化液诱导大鼠EAE动物模型，应用龟鹿益髓胶囊作为治疗药物，以泼尼松作为对照药物，观察脑脊髓炎大鼠发病情况，T淋巴细胞增殖及血清中IL?2，IL?4，IL?6，TNF?α的水平。结果龟鹿益髓胶囊能明显抑制EAE发病，减轻其病情，同时对MBP诱导的脾T淋巴细胞增殖，血清IL?2，IL?6，TNF?α活性有明显抑制作用，对ConA诱导脾淋巴增殖，IL-4具有增强作用。结论龟鹿益髓胶囊对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有增强作用，而对MBP诱导的T淋巴细胞增殖具有抑制作用。而泼尼松片对两者诱导T淋巴细胞增殖均有抑制作用。大剂量龟鹿益髓胶囊能抑制IL?2，IL?6，增强IL?4的活性，调节免疫功能，从而抑制EAE发病，提示中药龟鹿益髓胶囊通过调节体内紊乱的免疫功能起到治疗作用。

【关键词】 实验性脑脊髓炎 龟鹿益髓胶囊 发病情况 T淋巴细胞增殖 细胞因子

　　多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是一种T细胞介导的中枢神经系统脱髓鞘疾病，好发于20～40岁的青壮年女性，致残率高，复发率高，给社会、家庭和个人造成了极大的经济和心理负担。现代研究已经发现本病患者脑内广泛存在髓鞘特异性T淋巴细胞，活化的T淋巴细胞通过血脑屏障（BBB），可分泌多种细胞因子，这些细胞因子再通过免疫机制或直接作用导致髓鞘的脱失，而引起脑和脊髓的炎症反应和脱髓鞘变化〔1〕。
本实验中通过中药龟鹿益髓胶囊对MS模型(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis , EAE )-脑脊髓炎发病情况、脾T淋巴细胞增殖、血清中IL?2，IL?4，IL?6，TNF?α的影响，来探讨本药治疗MS的药效学研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物健康wistar大鼠，清洁级，雌性，70只，体重180～200 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2002-2003。健康DH豚鼠，清洁级，雌性40只，体重250～350 g，购于河北省实验动物中心，许可证编号SCXK（冀）2003-1-003。

　　1.2 试剂及药物完全福氏佐剂ConA，3H-TdR，MBP，美国Sigma生产。IL-2，IL-4，IL-6，TNF-α放免试剂盒购于北京301医院放免研究所；龟鹿益髓胶囊，由石家庄以岭药业股份有限公司提供；泼尼松片（阳性药），由浙江仙琚制药股份有限公司提供。

　　1.3 实验分组及给药将70只健康的雌性wistar大鼠随机分为6组，分别为空白对照组10只，模型对照组、泼尼松片组、龟鹿益髓胶囊大剂量（10.24 g生药/kg）、中剂量（5.12 g生药/kg）、小剂量（2.56 g生药/kg）组，每组各12只。按照文献复制脑脊髓炎模型〔2〕。取新鲜豚鼠，麻醉处死，取出脊髓，除去基膜，称重后放入组织研磨器，加入等量的生理盐水研磨成50%的豚鼠脊髓匀浆液。将等体积的脊髓匀浆和完全福氏佐剂充分乳化，形成油包水乳剂，卡介苗的终浓度为6 mg/ml。空白组乙醚麻醉后4个足垫及背部共5个部位，每个部位0.1 ml，共0.5 ml；模型组乙醚麻醉后在同样部位注射抗原乳剂。实验日计为0 d，以后每天称重并观察病情变化，时间为1个月。

　　1.4 观察方法

　　1.4.1 观察发病情况观察各组动物的发病潜伏期、体重损失情况、发病率、死亡率、症状体征等，症状体征参考文献〔3〕评分：0为正常；1为尾无力；2为后肢无力；3为单侧后肢麻痹；4为双侧后肢麻痹；5为双侧后肢麻痹和尿失禁。30 d后对致死率、发病率、发病潜伏期、症状评分、体重进行综合评价。

　　1.4.2 检测脾淋巴细胞增殖情况各组大鼠断头处死后，无菌摘取脾脏，分离成单个细胞。96孔细胞培养板每孔加入用20%小牛血清RPMI1640（Gibco公司）液含5×106/ml的大鼠脾淋巴细胞悬液100 μl，然后加入用RPMI1640液稀释的2 μg/ml的ConA100 μl，或10 μg/ml的MBP100 μl〔4〕，每组设复孔12个。放37℃，5% CO2和饱和湿度孵温箱培养56 h，分别向每孔加入以RPMI1640液配制的10μl（370 KBq）/ml 3H-TdR（北京原子高科核技术应用股份有限公司）20 μl（7.4KBq）继续培养16 h。用Herveste在96型细胞收集仪（Tomte公司）收集样品于1450-421型滤纸膜垫A（Perkin Elmer公司）上，放80℃，20 min烘干后，装入1450-423型MicroBeta样品袋中，加入闪烁液后往wallac 1295-0120型热封机封闭放固定架内，置MicroBeta tritux 1450型微量液闪仪（perkin Elmer公司）中，检测（计数）每孔样品的放射性强度，以cpm值表示。

　　1.4.3 采血检测IL-6，IL-2，IL-4，TNF-α活性每只发病动物均于濒死状态下处死，空白对照组及发病后未死亡动物及未发病动物于4周后处死。每只动物于处死前均先麻醉，无菌操作心脏采血3 ml只，将采取血液经低温冷冻离心机离心取血清，然后用全自动C-计数仪分别检测IL-2，IL-6，IL-4，TNF-α (具体步骤按照放免药盒说明书操作)。

　　1.5 统计方法

　　应用美国Stata 4.0版软件对发病潜伏期、体重损失、症状体征、症状评分、T淋巴细胞增殖、细胞因子进行单因素方差分析，对发病率和死亡率进行χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 各组动物临床发病情况空白对照组10只大鼠没有发病且体重呈持续增加，毛色光亮，活动正常，食欲较好。模型组大鼠发病时出现毛色变暗、体重下降、尾部无力下垂、后肢瘫痪等临床症状，并有大小便失禁，甚至死亡，和预实验结果相同，证明模型复制是成功的。各给药组大鼠症状有不同程度的改善。见图1～4。

　　2.2 龟鹿益髓胶囊对EAE大鼠发病率、潜伏期、最高评分和致死率的影响各组最高症状评分、潜伏期比较。泼尼松片组最高症状评分降低，与模型组比较（P0.01），发病潜伏期有延长的趋势。龟鹿益髓胶囊小剂量组大鼠发病潜伏期延长与模型组比较（P0.05），最高症状评分有降低的趋势；龟鹿益髓胶囊大、中剂量组发病潜伏期延迟（P0.01），最高症状评分降低（P0.01）。 结果见表1。表1 龟鹿益髓胶囊对EAE大鼠发病率、潜伏期、最高评分和致死率的影响（略）

　　2.3 龟鹿益髓胶囊对脑脊髓炎大鼠T淋巴细胞增殖的影响在ConA诱导下，模型组淋巴细胞转化降低，泼尼松组淋巴细胞转化降低，龟鹿益髓胶囊组淋巴细胞转化升高，和模型组相比有显著性差异（P0.01）；在MBP诱导下，模型组淋巴细胞转化升高，泼尼松组淋巴细胞转化率较模型组降低，龟鹿益髓胶囊组淋巴细胞转化率降低，和模型组比较有显著性差异（P0.01）。结果见表2。

　　2.4 龟鹿益髓胶囊对EAE大鼠IL-6，TNF-α，IL-2，IL-4的影响模型组血清中TNF-α，IL-2和IL-6升高，IL-4降低；泼尼松片组TNF-α，IL-2和IL-6降低，IL-4升高，和模型组比较有显著性差异（P0.01）；龟鹿益髓胶囊小剂量组各项指标较模型组有一定程度的改善，但无显著性差异（P>0.05）；中剂量龟鹿益髓胶囊可升高IL-4，抑制血清IL-2，IL-6的活性，与模型组比较有统计学意义（P0.05）；大剂量龟鹿益髓胶囊抑制EAE大鼠血清中IL-2，IL-6的活性，升高IL-4，和模型组比较，有差异或显著性（P0.05或 P0.01）。结果见表3。