熊胆冻干粉针剂对缺氧(一)

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作者：金光显， 任香善， 林贞花， 宋京郁， 玄延花， 金贤国

【关键词】 熊胆；,,血管内皮；,,丙二醛；,,一氧化氮

　　摘要：目的探讨熊胆冻干粉针剂对缺氧-再复氧损伤的血管内皮细胞的保护作用及抗动脉粥样硬化机制。方法采用脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）体外原代培养方法。通过倒置相差显微镜观察和比较，各组内皮细胞形态，用MTT法检测吸光度值，利用比色法测定细胞上清夜中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nitric oxide ，NO）含量。结果 MTT法结果显示：正常组、熊胆组与缺氧－再复氧组比较有显著差异（P0.01）。缺氧-再复氧组的MDA含量增高，而NO含量降低，正常组和熊胆组中检测结果相反。结论 熊胆冻干粉针剂对缺氧－再复氧损伤的血管内皮细胞有保护作用。

　　关键词：熊胆； 血管内皮； 丙二醛； 一氧化氮

　　Protective Effects of the Lyophiled Powder Injection of Bear Bile on Vascular Endothelial Cells Induced by Hypoxia-reoxygenation Injury

　　Abstract：ObjectiveTo study the protective effects of the lyophiled powder injection of bear bile on cultured vascular epithelial cells (VEC) induced by hypoxia-reoxygenation injury, and study the mechanisms of anti -atherosclerosis. MethodsBy using primary culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in vitro, the VECs were divided into three groups.The morphological changes of VEC by the inverted microscope, the optical density (OD) value of cells were detected by MTT colorimetric method, content of MDA and NO in the supernatant fluid of cultured cells were detected by spectrophotometry.ResultsThe MTT assay showed that OD value had significant difference (P0.01) between normal group, bear bile group and hypoxia-reoxygenation group. The MDA content increased and NO content decreased in the hypoxia-reoxygenation group, in contrast, MDA content decreased and NO content increased in the normal and bear bile groups. ConclusionThe results indicate that the lyophiled powder injection of bear bile has protective effects for the HUVEC injury induced by hypoxiareoxygenation injury .

　　Key words：Bear bile; Vascular epithelial cell; Malondiadehyde; Nitric oxide

　　缺血-再灌注是再灌注心肌损伤、缺血性脑卒中等严重疾病中常见的过程。缺血缺氧极易导致血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)的死亡和严重功能紊乱，从而进一步加重组织损伤。目前关于缺血-再灌注时细胞损伤的机制及对其的保护的研究主要集中在神经细胞和心肌细胞，对VEC的研究极少。本实验通过用连二亚硫酸钠造成缺氧－再复氧模型后用熊胆，观察其抗缺氧作用及其机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 人脐静脉内皮细胞 人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），以酶消化法取得。

　　1.1.2 试剂与主要仪器 熊胆冻干粉针剂由延边大学药学院提供。人第八因子相关抗原（Ⅷ因子）是美国 Santa cruz 产品，一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）检测试剂盒购置于南京建成生物有限公司。M199培养基为美国GIBCO公司产品；胎牛血清为美国HYCOLONE公司产品；连二亚硫酸钠为沈阳市东兴试剂；MTT为SIGMA公司产品。倒置相差显微镜，日本OLYMPUS产品，37度CO2培养箱是德国SL产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 脐静脉内皮细胞的分离及培养 按Jaffe等〔1，2〕的方法略加修改进行。在无菌条件下，取健康产妇分娩后6 h以内的脐带， 灌注0.1%Ⅰ型胶原酶（collagenaseⅠ）10～15ml，置37℃水浴中孵育15～20 min。收集含有细胞的酶液，放入离心管中, 1 000 r/min离心10 min, 沉淀中加入含有20％ FBS，50 U/ml肝素、终浓度为2 mg/ml的L谷氨酰胺的完全M199培养液5 ml，充分混合制成细胞悬液，以（1.5~2.0）×104/cm2密度植入培养瓶中，置37℃，5％ 的CO2培养箱中培养，待细胞长成融合状态后进行鉴定。

　　1.2.2 分组及药物处理 实验随机分为3个组：分别为缺氧-再复氧组，正常组和熊胆组。熊胆组的熊胆终浓度分别为60，80，120 μg/ml和160 μg/ml。细胞缺氧－再复氧损伤造模法：根据文献〔3〕略加修改，采用氧清除剂连二亚硫酸钠造成缺氧，种板培养24 h后，各孔弃去培养基，用无糖Earls液洗细胞2次，正常对照孔加入M199培养基；模型孔加入含连二亚硫酸钠终浓度为1.0 mmol/L的无糖Earls液，缺氧4 h后加入完全M199继续培养12 h，造成细胞缺氧再复氧损伤模型。熊胆组加入含连二亚硫酸钠终浓度为1.0 mmol/L的无糖Earls液，缺氧4 h后加入终浓度分别为60，80，120，160μg/ml 的熊胆，37℃ 孵育12 h。

　　1.2.3 MTT法检测内皮细胞存活率 取对数生长期的细胞制备细胞混悬液，接种于96孔培养板内，细胞浓度为（1～5）×105/ml，每组设8个平行孔，细胞处理同上。细胞置5％CO2培养箱孵育24 h，待细胞贴壁及基本长满时开始做试验。吸弃个孔液体，加入无血清M199培养基100 μl，再加入5 mg/ml MTT工作液20 μl，混匀，37℃孵育4 h。翻板法弃去孔内培养液，每孔加DMSO（二甲基亚砜）100μl，用微量振荡器摇震10 min，使充分溶解。在酶标仪490 nm处测量各孔OD值，以不加细胞孔调零，酶标仪自动打印结果。

　　1.2.4 形态学观察 倒置相差显微镜下直接观察内皮细胞生长情况。

　　1.2.5 MDA，NO测定 选用生长良好的HUVEC，制成细胞悬液，以浓度1×105/ml接种于24孔培养板。先用含20％的FBS的M199培养基，培养24 h后换用无血清M199培养基，实验方法同上，然后收集各孔上清液，按照北京邦定生物技术有限公司提供的试剂盒说明，用分光光度计法检测MDA，NO含量。

　　1.2.6 统计学处理所有实验数据均以±s表示，应用Excel软件进行t检验。