消癌平对Ec-9706食管癌细胞的作用及机制实验研究(一)

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作者：张明智，何振，吴广银，邢舴，宋敏，王瑞林

【摘要】 　　目的探讨消癌平注射液对人食管癌细胞(Ec-9706)的抑制作用及其作用机理。方法①观察不同浓度消癌平注射液对Ec-9706的抑制率。②用倒置显微镜，丫啶橙染色（荧光显微镜）观察细胞用药前后形态变化；流式细胞仪检测用药前后细胞周期变化；免疫细胞化学法检测CyclinD1表达。结果①消癌平40，20 ，10，5 mg/ml浓度时对EC-9706细胞的生长抑制率分别为（90.15±2.74）%，（68.02±3.56）%，（48.73±1.79）%，（22.52±2.08）%。其OD值与空白对照组差异有统计学意义(P0.05)。其IC50值为(10.89±1.05）mg/ml。②消癌平可诱导Ec-9706凋亡。③EC-9706经药物作用后，G0/G1期细胞百分比明显升高，S期细胞百分比明显下降，细胞被阻滞于G0/G1期。④Ec-9706在蛋白水平不表达CyclinD1。结论消癌平对Ec-9706细胞有较好的抑制作用。

【关键词】 消癌平； 食管癌细胞； 丫啶橙； 流式细胞术

　　Abstract:ObjectiveTo observe the inhibitory effect and mechanism of Xiaoaiping(XAP, a kind of traditional Chinese medicine) Injection on esophagus carcinoma cell line (Ec-9706). Methods①In vitro inhibition experiments were undertaken for Ec-9706 cells with XAP 40，20，10 and 5 mg/ml concentrations, respectively. ②The cellular shape was observed by invert microscope and acridine orange staining with fluorescent microscope, flow cytometry was applied to detect the difference of cell cycle, and immunohistochemistry was applied to the expression of CyclinD1. Results①XAP Injection could remarkably inhibit the growth of EC-9706 cells. When 40mg/ml, 20mg/ml, 10mg/ml, 5mg/ml XAP Injection was cultivated with EC-9706 cells, the IR was （90.15±2.74）%, （68.02±3.56）%, （48.73±1.79）%, （22.52±2.08）% respectively. The difference between every experimental group and control group was significant (P＜0.01). IC50 was （10.89±1.05）mg/ml. ②XAP could induce Ec-9706 cell line to apoptosis. ③Flow cytometry analysis showed that cellular periods were （59.56 ±1.73）%, （86.68±2.57）%, （83.26±1.86）% in G0/G1 period, respectively, after XAP Injection (10，20，40 mg/ml) mixed with Ec-9706 cellular strains for 48 hours . The differences between experimental group and control group were significant (P0.05). ④CyclinD1 didn't express in protein level in Ec-9706 cell line. ConclusionXAP appears to have good inhibitory effect on esophagus carcinoma cellular strains.

　　Key words:Xiaoaiping Injection; Esophagus carcinoma cell line; Acridine orange; Flowingcytometry

近年来，临床应用消癌平注射液治疗各种晚期恶性肿瘤，取得了改善症状、缩小及稳定瘤灶、提高生活质量、延长生存期的临床效果〔1，2〕。为了进一步证实消癌平的作用及作用机理，我们观察了消癌平对人食管癌细胞Ec-9706生长抑制作用。

　　1 材料

　　1.1 药品消癌平注射液由南京圣和药业有限公司提供，批号：200511281，棕黄色澄清液体，20 ml/支；顺铂(DDP) 齐鲁制药有限公司生产(生产批号:0504015)。

　　1.2 人食管癌细胞株(Ec-9706) 由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室王明荣教授惠赠。

　　1.3 CyclinD1免疫组化试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司。

　　2 方法

　　2.1 MTT比色法测定药物抗癌活性及IC50值 取对数生长期Ec-9706细胞，常规消化，用RPMI-1640配成单细胞悬液，以每孔104～105个细胞接种于96孔培养板中，常规培养24 h细胞大部分已贴壁，吸出原培养液，实验组加不同浓度的消癌平注射液的培养液，使其终浓度分别为40，20，10，5 mg/ml；阳性对照组加顺铂，终浓度为10 μg/ml；空白对照组加等体积生理盐水。每组设4个平行孔，另设本底对照孔。继续培养48 h后，加入MTT溶液，继续孵育4 h，加入DMSO，振荡，使结晶物充分溶解。选择570 nm波长，测定各孔光吸收值。计算生长抑制率（按以下公式），求IC50值。

细胞生长抑制率（%）＝对照组OD均值-实验组OD均值对照组OD均值×100%

　　2.2 形态学变化观察

　　食管癌细胞经15 mg/ml药物作用48 h后，置显微镜下观察细胞形态学的改变，并拍照记录。

　　2.3 丫啶橙荧光染色的观察

　　①将生长有培养细胞的玻片放入95%乙醇中固定，干燥；②在1%醋酸中酸化30 s；③加足量的0.01%丫啶橙磷酸缓冲染液，染色5～10 min；④用pH 4.8磷酸缓冲液洗1 min；⑤ 0.1 mol/L氯化钙分化30 s或几分钟；⑥PBS漂洗，封片；⑦在荧光显微镜下观察，用蓝紫光激发滤片。