化疗药物对膀胱癌细胞CCR9的表达影响及临床意义研究(一)

详细内容

【摘要】 目的：研究化疗药物对膀胱癌细胞的R9表达的影响，初步探讨R9在膀胱癌细胞的转移与侵袭中的作用。 方法：研究采用PCR法、流式细胞术以及趋化小室的体外侵袭实验等方法进行研究。结果：研究发现R9在膀胱癌细胞5637上高表达而在化疗药物处理组中低表达，同时发现L25与R9的相互作用影响膀胱癌细胞的转移和侵袭能力，初步证实了R9在膀胱癌细胞的转移和侵袭中的作用。

【关键词】 膀胱癌; R9; 转移; 侵袭

大多数肿瘤相关的死亡与转移有关，因此，将肿瘤的转移最小化已经成为大势所趋。目前为止，关于肿瘤的转移的细胞和分子机制还不清楚[1]，瘤细胞的扩散可能与其迁移、侵袭及归巢能力等众多因素相关，大多数肿瘤细胞的转移有着与白细胞的迁移有很多相似之处，如都通过趋化因子受体与配体的相互作用进行调节等机制，有研究已经证实R9的表达与多种肿瘤细胞的迁移和侵袭有关，如克罗恩病[2，3]、转移性黑素瘤[4，5]、慢性淋巴细胞性白血病[6]等，其作用主要是通过R9与其配体L25的相互作用实现[4，7～9]的，研究证实R9的高表达可以促进前列腺癌细胞的转移和侵袭能力[10]，在我们的研究中，我们对比药物处理前后的膀胱癌细胞初步证实R9同样与膀胱癌细胞的转移和侵袭能力相关，膀胱癌细胞高表达R9，化疗药物顺铂、干扰素a等处理组的细胞

　　1 材料与方法

　　1.1 主要的实验材料

　　膀胱癌细胞系5637细胞(由本研究室保存);RNA提取的主要 试剂Trizol、异丙醇;PE标记的抗人的R9抗体(购自eBiosience公司)以及同型对 照抗体PE标记的抗人的IgG2a;趋化小室购自Sigma公司;L25购自Sigma;卡介 苗BCG、干扰素a以及顺铂购自当地医院。

　　2 主要的实验方法

　　2.1 细胞培养

　　膀胱癌细胞系5637细胞购自中国典型培养物保藏中心(T)。37℃，5%CO2条件下含2mmol/L的谷氨酰胺及10%的胎牛血清的1640培养基培养5637细胞培养备用。药物处理组细胞加入大于常规剂量的药物处理24 h。

　　2.2 RNA提取和R9表达的分析

　　人R9的mRNA的序列从GenBank中获取(XM003251)，使用Primer5.0软件设计引物进行RT?PCR分析，扩增产生162bp大小的 R9。常规方法提取膀胱癌5637细胞以及药物处理后的细胞的RNA，分别收集未处理组及化疗药物处理组细胞2*106/组，加入1ml TRIZOL溶液，用手反复摇匀至细胞碎块完全被裂解，然后将上述样品静置15～20min后，每管加入0.2ml氯仿(0.2ml/ml)，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min;将EP管置于高速台式冷冻离心机;在4℃ 12000r/min离心10min;小心吸取上层水相置于另一无菌的新的EP管中;于管中加入05ml异丙醇，室温沉淀10min;4℃ 12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75%无水乙醇洗两次;最后让沉淀的RNA在室温自然干燥;每管用8～10μl无RNAase的纯水重悬干燥后的RNA，置于冰浴立即用于cDNA合成或置-70℃长期保存。

　　2.3 流式细胞术测定化疗药物处理前后膀胱癌细胞表面R9的表达

　　收集化疗药物处理前后的5637细胞，2*106/组，每组细胞加入1微克的PE标记的抗人的R9抗体或PE标记的抗人的IgG2a同型对照抗体，4℃孵育30min;含1%BSA的PBS洗3次后流式细胞仪检测。

　　2.4 膀胱癌细胞迁徙与侵袭实验

　　L25购自PeproTech公司，未标记的鼠抗人的R9抗体购自R&D公司。先将100微升5 mg/ml 的Matrigel加到24?transwell的上室中，37℃孵育5 h，然后用无血清培养基轻洗凝胶，备用。在上室中加入200微升细胞悬液(2×106个/毫升)，下室中加入200微升含0.5%BSA的RPMI1640，其中L25终浓度为0ng/ml及100ng/ml 。 此外，为了阻断趋化因子受体之间的相互作用，同时设定在上室中加入1.0微克/毫升的鼠抗人的R9抗体与100ng/mlL25的对照组。置于温箱中孵育1h。然后将膜轻轻取下，放于1%的考马斯亮蓝中染色5分钟，PBS清洗后在显微镜下计数细胞数。

　　3 实验结果

　　3.1 不同化疗药物处理前后膀胱癌细胞R9的RNA表达水平比较

　　收集未经化疗药物处理的膀胱癌细胞及经药物处理24小时的细胞，提取其mRNA并经RT?PCR法检测发现，与未经化疗药物处理组相比，经药物处理后，膀胱癌细胞的R9的mRNA的表达水平显著下降(*P0.05)，顺铂处理组下降最显著(**P0.01)。见图1。

　　3.2 流式细胞术检测药物处理前后膀胱癌细胞表面R9表达的变化

　　收集细胞，以PE标记的抗人的R9抗体进行标记，以PE标记的抗人的IgG2a抗体作为同型对照抗体，流式细胞仪检测R9的表达，发现经化疗药物处理各组的R9表达水平明显下降(*P0.05)，见图2。

　　图1 经药物处理后膀胱癌细胞的R9的mRNA的

　　表达水平显著下降

　　图2 经化疗药物处理各组的R9表达水平明显下降

　　3.3 细胞迁徙与侵袭实验

　　肿瘤细胞迁徙及侵袭实验结果显示，无论是化疗药物未处理组的膀胱癌细胞还是药物处理后的细胞，在没有L25参与的情况下，细胞几乎没有迁移作用;但当加入100ng/ml的L25后，细胞即发生迁移，且未经化疗药物处理的膀胱癌细胞迁移率明显高于药物处理组细胞,加入R9抗体后，其迁移率便降低(图3A，*P0.01);与迁徙实验一样，实验发现膀胱癌细胞的侵袭能力也与R9、L25相关，化疗药物处理后，其侵袭能力降低(图3B , *P0.05)。

　　图3A 膀胱癌细胞的侵袭能力与R9、L25相关

　　图3B 化疗药物处理后膀胱癌细胞的侵袭能力降低