地塞米松诱导小鼠腭裂动物模型的建立(一)
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作者：刘贤 齐志丽 刘杨 田悦明 王浩宇 吴靖芳 郑慧娥 任君旭 安峰
【摘要】 目的：探讨地塞米松诱导小鼠腭裂动物模型的建立方法。方法：采用一次性腹腔注射地塞米松的方法，建立腭裂模型鼠。取孕12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d胚胎头部，石蜡包埋，6μm切片，HE染色，观察腭发育过程腭突的变化。结果：妊娠第11.5d一次性给予地塞米松(Dex)1mL(用量为50mg/Kg)可诱发小鼠产生腭裂。模型组腭突体积瘦小，不能在中线区接触融合，以致不能与腭突上方的鼻中隔接触融合，胎鼠出现腭裂。结论：妊娠第11.5d一次性给予小鼠足量地塞米松，可成功建立腭裂动物模型。为研究腭裂形成原因及分子机制提供了一个较好的模型。
【关键词】 地塞米松；腭裂；模型/动物
【ABSTRACT】 Objective：To investigate the method of constructing the model of cleft palate induced by dexamethasone(DEX)．Methods：The cleft palate mouse embryo model was got by injecting DEX intraperitoneally into Kunming mice．The heads of the mouse?s embryo were got from GD12.5 to GD16.5,then fixed with Bouin?s solution,embedded by paraffin,sectioned 6μm and HE stained．The changes of palatine process were observed during the development course of cleft．Results:Cleft palate at GD 11.5 could be induced by injecting DEX at the dose of 50mg/kg once.The palatine process and anasl septum,which could not contact and merge each other,was thin and small in the model group so as to develope palate cleft on the embryo．Conclusion:Injecting enough dose DEX once at GD11.5 can induce the cleft palate mouse embryo model suessfully．It is a perfect model for studying the reasons and mechanism of cleft palate forming．
【KEY WORDS】 Dexamethasone,Cleft Palate,Models/Animal
腭裂动物模型在腭裂病因学、形成机制及治疗方法等研究中具有重要作用[1]。先天性腭裂的发生率约为0．1%，其发生主要是由于早期发育过程中腭突融合障碍所致，通常是遗传及环境因素相互作用的结果，其中妊娠早期误服药物也可能是其发生原因之一。在胚胎发育过程中腭的正常发育在很大程度上取决于环境因素，与腭裂发生有着密切的关系。胚胎腭器官发生期是器官的形成过程，同时又是胚胎的致畸敏感阶段。本实验拟通过对胚胎发育的渐进性形态学观察，揭示腭发育及腭裂形成过程，从而建立腭裂动物模型。
1 材料与方法
1．1 实验动物
成年健康未生育昆明小鼠（体重为22～25g）（北京大学医学部实验动物中心），胎鼠为孕12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d（足月为19～21d）。
1．2 实验材料
试剂：醋酸地塞米松注射液（华北制药集团）、PBS液（0．01M）、Bouin?s固定液、酒精、苏木精?伊红染液、生理盐水；仪器：OLYNPUS BX?31，Motic 6.0医学图像分析系统和手术器械，如镊子、解剖刀、解剖剪、止血钳、注射器、培养皿。
1．3 模型的建立方法
随机选取健康、生活状态相近的小鼠，雌雄按2∶1于晚18∶00合笼，并于次日早7：30检查雌性小鼠的阴栓，查见阴栓之日定为孕0d（0GD），第11天14∶00定为孕11.5d（11.5GD）[2]。所有小鼠均自由饮水及标准小鼠饲料喂养，孕鼠随机分为模型组和对照组，每组各20只孕鼠。模型组孕鼠于妊娠第11.5d腹腔内注射50mg/Kg地塞米松，诱发胚胎腭裂畸形；对照组孕鼠于妊娠第11.5d腹腔内注射等量生理盐水。各组孕鼠分别于12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d以颈椎脱臼法处死，并立即于冰块上操作，剖腹取出胎鼠。
1．4 取材方法
取出胎鼠的方法：孕鼠处死后取仰卧位，立即放置于冰块上固定，在小鼠腹中线最底部阴道口上方皮肤剪开“一”字形切口，然后向头部作“U”形皮瓣，充分暴露腹腔器官。其中可见双角子宫位于腹腔的两侧以及带有胎盘和羊膜的胚胎成串珠样排列于子宫中，不同生长期的胎鼠体积大小不一。用剪子分离子宫与阴道相连的部位，取出胎鼠立即放至盛有冷PBS液（4℃，0.01M pH 7.2～7.4）的培养皿中，并用镊子剥离胎盘和羊膜，PBS洗涤，Bouin固定液24h，使固定液充分穿透组织。
分离胎鼠头部方法：由于胎鼠体积大小不一，12.5d、13.5d、14.5d的胚胎在包埋前头部与身体可不分离。15.5d、16.5d的胎鼠沿口裂与耳廓连线的平行线自颈部断头，分离时避免伤害小鼠头部。分离的小鼠头有去下颌、不去下颌两种。去下颌应用镊子打开胚胎口部，刀片切除下颌，眼科镊子取出舌，以便于观察小鼠是否有腭裂。分离后的小鼠头重新固定于Bouin?s液中。
1．5 切片、染色
制作方法：12.5d、13.5d、14.5d的整个胚胎、15.5d、16.5d的鼠头梯度酒精脱水、浸蜡后常规石蜡包埋，包埋时小鼠喙部朝下。12.5d、13.5d、14.5d的胎鼠须经溶蜡后取头重新包埋。包埋好后准备用于切片，切片时以麦克尔软骨为基准面，作冠状位连续切片，切片厚约6μm。石蜡切片经脱蜡、水化、蒸馏水洗涤、苏木精染色、自来水洗、0.5%盐酸酒精分化、自来水蓝化、伊红染色、脱水、透明、封片，光镜观察。
2008年6月刘 贤等：地塞米松诱导小鼠腭裂动物模型的建立第3期2008年6月河北北方学院学报（医学版）第3期2 结果
2．1 肉眼观察
肉眼观察只适用于15.5GD、16.5 GD去下颌的胎鼠。通过观察可以发现在胎鼠腭部正中有一边缘不太规整的裂隙，其长度、宽度不一，长度一般为1.5～3.0cm（图1）。不同时期的胎鼠裂的大小不同，形状也不尽相同。