环氧化酶与发热(一)
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作者：刘华钢， 阳洁， 杨斌， 赖茂祥
【关键词】 发热；,,环氧化酶,
摘要：综述了环氧化酶 (cyclooxygenase,COX)3种同功酶的生物学特性、在发热过程中的作用及与 COX有关的发热的治疗，指出在 COX的3种同功酶中，与发热关系密切的是 COX2，COX1可能与发热的关系不大，而 COX3是否与发热有关，还很有争议。
关键词：发热； 环氧化酶
环氧化酶(cyclooxygenase,COX)又称前列腺素H合成酶（prostaglandins H synthase,PGHS），是一种膜结合性糖蛋白，是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代谢途径中合成各种前列腺素(prostaglandins,PGs)的关键限速酶，兼有环氧化酶和过氧化酶双重功能〔1〕。磷脂酶A2 (phospholipaseA,, PLA2)受各种因素刺激活化后水解膜磷脂释放出AA，AA在COX作用下生成不稳定的中间产物PGG2，PGG2在过氧化酶活性作用下又转变成各种前列腺素的共同前体PGH2，PGH2可被不同的PG异构酶作用转化成小分子的活性终末产物，如PGE2、PGF2 、PGD2 、PGI2、血栓素 (thromboxane ,TXA2 , TXB2)等。COX广泛参与机体的多种生理及病理过程，如炎症、发热、出凝血机制、免疫调节及肿瘤的发生发展等，是近年的研究热点。现就近年来COX与发热的研究进展综述如下。
1 COX的生物学特性
目前认为，COX有COX1、COX2、COX3三种同功酶。人COX1基因长约22.5 kb，定位于第9号染色体9q32~33.3，由11个外显子和10个内含子构成；人COX2基因约长8.3kb，定位于第1号染色体1q25.2~25.3，由10个外显子和9个内含子构成，与COX1具有61%的同源性。人类的COX3 mRNA是由9号染色体编码的，但mRNA中保留了内含子 1，其中包含开放读码框架。犬COX3全长2 706bp，人COX3约5.2 kb。COX1和COX2均为71 kD的膜结合蛋白，而且长度几乎相同，约600个氨基酸。同一种属的COX1和COX2间有60%~65%同源性，而不同种属间每种酶有85%~90%同源性。两者的主要区别是COX2在N端含有17个氨基酸残基的较短粘性信号肽，而COX1的N端为较大的疏水性信号肽；COX2在C端含有1个特异性的18个氨基酸残基片段(NASSRSGLDDINPTVLLK)，而COX1不含此片段。缺失此段基因对COX2的催化活性没有影响，但此序列很可能与COX2蛋白的快速降解有关〔2〕。COX3是一种相对分子质量为65 000的膜结合蛋白，具有糖基化依赖性COX活性，根据物种不同，可在疏水性信号肽插入30~34个氨基酸，引导酶进入内质网腔和核被膜。COX3还保留有内含子序列，这可以显著改变酶的特性，使该酶的生物学活性与完全拼接形成的COX1不同〔3〕。COX1和COX2的X射线晶体结构非常相似，三维空间结构约有60%是相同的。两种同功酶在疏水通道间的氨基酸组成略有差异，COX1在434和523位是异亮氨酸，而COX2在这两个位点是缬氨酸，因缬氨酸体积较小，所以使COX2具有更大的活性位点，可接受更广范围的脂肪酸作为底物，比COX1多大约25%的抑制剂结合位点〔4〕。至于COX3的晶体结构目前还不太清楚。COX1一般在胃黏膜、肾、血小板、中枢神经系统 (central nervous system,S)、单核细胞和巨噬细胞等组织细胞中呈原生型表达。COX2则在S(包括大脑皮质、海马、下丘脑等)、胃肠道、肾、肺、骨骼和生殖系统（前列腺、睾丸、子宫等）中呈原生型表达〔5〕，在单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞和滑膜细胞等细胞中表现为诱生作用〔3〕。COX1和COX2的组织分布随物种的不同而有差异，甚至同一组织中也存在差别。在大、小鼠脑中主要是COX1的表达，人脑中两种酶都有同等程度的表达。在大鼠胃中，COX2分布在表面黏膜细胞内，COX1分布在黏膜颈细胞内。COX同功酶的分布在细胞水平也有所不同，COX1主要定位于内质网，而COX2则定位于内质网和核膜，且COX2在核膜的免疫反应是内质网的2倍。而COX3在人的成熟大脑和脊髓有丰富表达，但在胎儿的S却缺乏。COX3 mRNA在大鼠脉络丛和脊髓中的表达水平最高，其次是脑垂体、下丘脑、海马、髓质、小脑、皮层〔6〕。COX1由“看家”基因编码，一般情况下酶的表达量相对稳定，受刺激后其表达仅上升2~4倍；而COX2由“炎症反应基因”编码，是一种诱导性即刻反应基因，在正常生理状态下多数组织内检测不到，在各种刺激因素作用下便可从头合成，COX2 30 min内迅速增加，并保持6～8 h， 24 h后降至基础水平，其表达可上调10~80倍〔7〕。诱导COX表达的刺激因素很多，广泛存在于细胞内外，主要包括细胞因子、生长因子、内毒素、致癌物（如佛波酯）、癌基因及癌基因产物等。各种刺激因素有各自不同的胞内信号传导系统且具有组织特异性，例如紫外线可以通过激活P38 MAPK使COX2过表达，该过程可以被MAPK抑制剂SB202190抑制〔8〕；脂多糖能通过PKC/ ERK/ NFκB信号通路促使COX2基因表达，维生素E则能抑制该通路使COX2基因表达减少〔9〕。其他一些信号传导系统还包括通过G蛋白偶联机制、酪氨酸激酶介导的通路、生长因子受体等。 由于COX1在多数成年哺乳动物中的表达水平没有太大变化，因此很难对它的转录调节进行研究，而COX2基因表达的调控主要在转录和转录后水平上进行〔10〕，并且同蛋白产物的合成及降解也有关系。COX1和COX2的转录产物和5'调控区、3'UTR区不同是其调控作用有显著差异的原因。COX1和COX2基因的转录产物长度分别为2.8~3.6kb和4.0~4.1 kb。COX1的5'调控区为2.4 kb，而COX2基因的5'调控区长度为1kb。COX2的5'调控区含有许多与转录有关的序列，如cAMP反应元件(CRE)、NFκB识别位点、AP1识别位点、IL6反应元件、AAT增强子结合蛋白、Sp1、PEA 3、GATA 1以及糖皮质激素反应元件等，这些结合位点与转录起始点的距离很近，接受不同的外界刺激后产生反应，经过一系列信号传递，将细胞受到的刺激表现于5'端转录起始点的调控系列，从而激活 COX2基因转录，实现基因转录水平的调控〔11〕。COX2 mRNA的3’UTR区含有22个 AUUUA重复基序（该重复基序在多种即早转录基因中存在），从而使 mRNA倾向于迅速降解，这与 COX2 mRNA不稳定、容易降解有关。皮质类固醇激素（如地塞米松）、IL4、IL10、IL13、干扰素 γ(IFNγ)、氧化性磷脂、COX2抑制剂及丝裂原活化蛋白激酶( MAPKs)抑制剂等可通过降低COX2 mRNA的稳定性和(或)干扰翻译过程而抑制COX2表达。至于COX3，目前有关其表达和调控方面的研究还比较少。Kis等〔6〕研究认为，COX3 mRNA在大鼠 S中表达主要与血管密度有关。Boutaud等〔12〕发现，低浓度的氧化剂和 AA水平有助于对 COX的抑制，COX3 N端结构的变化使其暴露于含有低浓度AA的氧化还原微环境中，从而影响对乙酰氨基酚对其的抑制作用。在所有对 COX1和 COX2不敏感的药物当中，对乙酰氨基酚和非那西丁对 COX3的抑制作用最强。
2 COX在发热过程中的作用
发热过程中，内生致热原 (Endogenous pyrogen,EP)能刺激多种细胞的 AA代谢，尤其是，视前区下丘脑前部（The preoptic area and anteriorhypothalanus.） PO/AH区的神经细胞，其 PLA2被介导活化后会以 AA为底物激活 COX通路，使 COX通路的PGs等合成增多，一些 EP还能直接使 COX表达和 AA代谢增加。国外曾利用 COX，EP，IL1，IL1R，ICE，IL1ra，IL1，RacP，IL6，IL10，TNFR及 cPLA2基因敲除小鼠对不同致热原性发热的机制进行研究，他们发现，各种发热的诱导都需要AA→PGE2级联反应系统的参与，而非 PGE2依赖性信号转导系统则都对发热机制的作用微乎其微（物理性应激反应引起的体温升高可能例外）〔13〕。目前认为，在 COX的3种同功酶中，与发热关系密切的是COX2〔14〕，如在小鼠模型中敲除COX2基因，能使发热终止，而敲除COX1基因对发热无阻断作用。在退热过程中，COX2被诱导表达，PGE2上升，而与COX1基因无任何关系〔15〕。下丘脑前部表达 COX2的转基因小鼠的发热反应比非转基因小鼠明显得多，并且转基因小鼠的发热反应在给予LPS后12h有一个明显的上升，因此Svetlana等〔16〕认为是诱导性的COX2在发热反应中发挥了作用。Willoughby等〔17〕也发现，COX2基因敲除小鼠的发热作用减弱，COX2抑制剂的解热作用显著降低。此外，国外还采用 COX2的定位杂交技术对 LPS致发热大鼠脑组织 COX2mRNA的表达进行了研究，认为引起发热的 PGE2来源于脑血管及柔脑膜〔18〕，进一步的研究认为主要是脑血管中的内皮细胞通过 COX2提高了PGE2的水平而引起发热〔19〕。Matsumura等证实，循环中的内毒素能诱导下丘脑血管上皮细胞中 COX2的表达，COX2产生的PGs再透过血脑屏障进入 OVLT区，从而引起发热〔20〕，并且他们还发现，LPS诱导的大脑脉管系统和柔脑膜的 COX2 mRNA表达是引起发热的原因〔21〕，同时他们还进一步证实，在给予 LPS后，COX2 mRNA和蛋白在脑室附近的血管和蛛网膜下腔被诱导表达，并且 COX2 mRNA和蛋白被诱导表达的时间进程与发热相平行〔22〕。可见， COX2或 COX2的亚型/变异体在发热中起主导作用的可能性远高于 COX1或 COX3〔23〕。但 COX2的许多功能仍不十分清楚，它在发热中的作用究竟怎样，仍需要进行大量深入的研究。对于COX1在发热过程中的作用，现有的研究表明，COX1可能与发热的关系不大。Steiner等〔24〕证实，对低剂量 LPS引起的单相发热和高剂量 LPS引起的多相发热，其第一阶段的发热反应在 COX1基因敲除小鼠中均减弱，而在 COX2基因敲除小鼠中均消失，并且在 COX2基因敲除小鼠中，多相发热的第二三阶段也均消失。这不仅提示 COX2在静脉注射 LPS引起的早期发热反应中（包括单相发热和多相发热的第一阶段）的关键性作用，同时也说明 COX1基因包括其产物都与这些反应无关。而对于 COX3在发热过程中的作用如何，目前还知之甚少并且很有争议。Kis等〔25〕发现，与 COX2不同，LPS刺激后 COX2的表达上升几倍，而 COX3mRNA和 COX1一样，表达并没有发生明显改变，提示 COX3的表达不受 LPS的刺激。同时，在啮齿类和人类， COX3编码的蛋白与 COX1、COX2的氨基酸序列完全不同并且没有 COX活性，因此他们认为 COX3在这些物种中不可能起到介导发热的作用〔26〕。Shaftel等〔27〕在小鼠中获得了类似的实验结果。另有研究表明，COX3主要与痛觉关系密切，而与发热反应无关〔28〕。因为 COX3主要在大脑皮质、心脏组织中表达，与发热相关部位并不一致，虽然对乙酰氨基酚具有较好的解热作用，但对 COX3无影响的 COX2选择性抑制剂仍有明显的解热作用，因此推测，参与发热反应的可能另有其他亚型，并且参与发热反应的 COX还可能不止一种。但也有观点与之相反，认为 COX3在发热机制中也具有重要作用〔3〕。
3 与 COX有关的发热的治疗
近年来，国内外学者通过对 NSAIDS非甾体类抗炎药物（Nonsteroidal antiinflammatory drugs）的解热作用机制的进行大量研究后认为，NSAIDS的作用机制主要通过抑制 COX，阻止 AA转化为 PGs而发挥解热作用〔29〕。因此，如果抑制了COX，便足以抑制各种PGs的生成从而产生解热作用〔30〕。研究表明，COX2特异性抑制剂与非选择性 COX抑制剂一样具有退热作用〔31〕，特异性 COX2抑制剂美洛昔康具有较强的解热作用，能使发热者体温下降但对正常体温几乎无影响，动物实验也表明，特异性 COX2抑制剂能抑制 LPS诱导的体温升高而对大鼠的正常体温无影响。致热原（如LPS）刺激 S内的非神经细胞（如颅脑血管的内皮细胞和小胶质细胞）的 COX2表达增加，刺激 PGE2合成，从而直接作用于 PO/AH的体温调节中枢影响体温调节，而 COX2抑制剂可以抑制 LPS刺激的大鼠发热反应〔32〕。研究发现，NSAIDS对 COX2基因转录和翻译的影响在几种不同的细胞中得到不同的结果。美洛昔康能抑制 LPS所致大鼠发热，但却没有抑制 COX2蛋白的表达，推测美洛昔康是通过改变 COX2的活性起作用，这个结果与在 LPS刺激下阿司匹林、NS398和奈普生不影响 COX2 mRNA和蛋白的表达这一研究结果相符，而与吲哚美辛和吡罗昔康在一定程度上抑制IL1刺激下的人成骨细胞中 COX2 mRNA表达的报道相反〔33〕。某些动物和人细胞中，NSAIDs还能同时抑制 COX2酶的活性和 COX2的基因转录〔34〕。因此有学者推测，在发热过程中， NSAIDS对于 COX2基因表达的调节很可能在很大程度上受组织细胞特异性的影响，如不同的组织细胞中可能存在不同的 COX2亚型，或很可能存在不同的蛋白调节机制。此外，土屋千佳子等〔35〕在探讨大黄的解热作用及大黄的主要成分对AA代谢的影响时发现，大黄对于 LPS引起的大鼠发热反应有解热作用，并且大黄对 COX活性以及 COX2 mRNA的表达均有抑制作用，同时，大黄酸对LPS所致的 COX2 mRNA表达也有抑制作用，大黄素和番泻苷 A、B可通过显著抑制 COX活性从而阻止 PGE2生成。而齐云等〔36〕实验发现，桂枝汤对发热及低体温大鼠发挥体温双向调节作用时，对下丘脑中 PGE2含量也有或降或升的双向调节作用，并认为这可能是桂枝汤双向调节体温的作用机理之一，但桂枝汤的这种体温双向调节作用却并不依赖于下丘脑细胞中 COX活性的变化。