重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV(一)
详细内容
作者：王清,王锡波,徐龙强,于维林,于红,张文卿
【关键词】 巨细胞病毒
Rebinant PP150 of human cytomegalovirus as antigene for colloidal gold immunodot assay to detect HCMVIgM in sera
【Abstract】 AIM: To use rebinant pp150 of human cytomegalovirus (HCMV) in colloidal gold immunodot assay (CGIDA) for the detection of HCMVIgM in sera. METHODS: A fragment of gene coding for pp150 antigen epitopes (840-1048aa) was expressed in E. coli and the fusion protein was purified. The results were pared with those of specific antibodies ELISA IgM. RESULTS: Rebinant antigen CGIDA had a good agreement (96.0%) with ELISA kit. The specificity of CGIDA was 100% and the sensitivity was 74.2%. CONCLUSION: Rebinant pp150 is an effective and valuable antigen used in CGIDA for detecting HCMVIgM.
【Keywords】 cytomegalovirouses,human;gene pp150;prokaryotic expression; gold colloidal; immunodot assay
【摘要】 目的: 探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于免疫滴金技术检测血清中抗HCMVIgM的诊断价值. 方法: PCR扩增HCMV pp150抗原决定簇（840～1048aa）编码基因片段，插入原核表探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术（CGIDA）检测血清中抗HCMVIgM的诊断价值. 达载体pMAlp2，转化宿主菌E.coli，诱导表达及纯化. 重组抗原CGIDA与酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒对比检测. 结果： 重组抗原CGIDA与ELISA试剂盒比较,符合率达96.0%；CGIDA检测HCMVIgM的敏感度为74.2%，特异性为100%. 结论: 重组抗原pp150用于 CGIDA对HCMV的早期诊断，具有较好应用价值.
【关键词】 巨细胞病毒, 人；基因pp150;原核表达；胶体金;免疫斑点法
0引言
胶体金免疫斑点法(colloidal gold immunodot assay,CGIDA)快速简便，吕贯廷等〔1〕成功地建立了CGIDA检测HCMVIgG的方法，但国内关于抗人巨细胞病毒(HCMV)IgM的临床检测的报道较少. 我们用基因工程方法合成HCMV pp150（841~1084aa）抗原,以胶体金为标记手段,建立了检测血清抗pp150 IgM抗体的胶体金免疫斑点法.
1材料和方法
1.1材料
HCMV AD169毒种、宿主菌E.coli DH5α, 原核表达质粒pMAlp2为山东省分子病毒学重点实验室提供. EcoR I, HindⅢ, T4 DNA Ligase, Wizard PCR Preps DNA Purification System, Wizard Plus Minipreps DNA Prurification Systems, IPTG, 硝酸纤维素膜（孔径0.65 μm）等均购自Promega公司. 麦芽糖结合蛋白(MBP)纯化树脂购自BioRad公司. 抗人IgM及HCMVIgM ELISA试剂盒由山东省分子病毒学重点实验室提供. HCMV IgM阳性血清120份经青岛大学医学院附属医院妇产科研究室提供（晶美生物工程有限公司人巨细胞病毒IgM ELISA试剂盒检测）; 266份临床血清采自青岛大学医学院附属医院正常孕妇. 正向引物： 5＇TGGCG↓AATTCATCTTGCTTCTTCGGC3＇，反向引物：5＇GTGTTA↓AGCTTCTATTTGTGTTCTT3＇，PCR产物长度为651 bp,产物上游酶切位点为EcoR1，下游酶切位点为HindⅢ.
1.2方法
1.2.1重组pp150抗原的制备HCMV AD169株接种人胚肺二倍体细胞，待细胞出现病变()后，收集细胞，提取总DNA作为模板，通过PCR扩增出HCMV pp150多个强抗原决定簇区目的基因. 分别用限制性内切酶EcoR I, HindⅢ酶切上述扩增片段和质粒pMALp2，回收酶切产物和载体片段，然后进行连接反应. 将连接产物转化感受态宿主菌E.coli DH5α，挑取经鉴定的单个菌落，37℃培养至A600 nm约为0.5. 加ITPG分别诱导1, 2, 3, 4, 5 h后收集菌体，在50 mmol／L TrisHCl（pH 8.0）溶液中超声波裂解（12 s/次，共3次），将沉淀溶于包涵体溶解缓冲液中(8 mol／L尿素，100 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，0.1 mmol／L PMSF，50 mmol／L TrisHCl，pH 8．0)，4℃, 6000 g离心10 min，回收上清. 每隔1 h用复性液(10 mmol／L GSH， 2 mmol/L GSSG，50 mmol／L TrisHCl，pH 8．0),将尿素浓度逐步降低到0.5 mmol／L，4℃复性过夜，在透析液(50 mmol／L TrisHCl，pH 8.0)中4℃充分搅拌去除剩余尿素. 4℃, 6000 g离心10 min，取上清，复性蛋白1．5 mL (0．5 g／L)上样，用麦芽糖结合蛋白（MBP）纯化树脂纯化（具体操作见说明书）. 应用150 g/L SDSPAGE检测表达及纯化情况.
1.2.2CGIDA试剂盒的置备及检测方法在300 mL双蒸水中加入10 g/L枸橼酸钠4.5 mL，煮沸后迅速加入0.2 g/L氯金酸3.6 mL ，继续煮沸10～15 min，冷却后用0.1 mol/L碳酸钾调pH值至8.5；取已纯化抗体作线性稀释，每管加入制备好的胶体金溶液1 mL，静置2 h,以保持红色不变的最小量管为胶体金与待标记蛋白的最适比例；取已纯化的抗原多肽与水溶性碳化二亚胺活化过夜，用PBS透析1 d；以3 mL胶体金溶液为基准，加入抗人IgM迅速混匀，15 min后加入10 g/L稳定剂7.5 mL，混匀，以1000 g 10℃离心40 min，弃上清夜，沉淀重悬于等体积10 g/L稳定剂(pH 7.2～7.4)中，1000 g 10℃离心30 min，弃上清液，沉淀用1/5体积恢复液恢复. 用孔径为0.65 μm的硝酸纤维素膜制成1 cm直径的方片， PP150蛋白、HCMVIgM（阳性对照）、PBS（阴性对照）3×3的点阵滴定后，将活化抗原稀释至浓度为0.25 mg/L，直接滴加于载体膜上，室温干燥后用10 mL/L牛血清白蛋白（BSA）封闭，再用10 μmol/L PBS洗涤3次，干燥后于4℃中保存. 将已凉干的抗原膜片装入塑料小盒中，盒内充满吸水材料；在膜盒的中央分别滴加血清标本,人HCMVIgM, PBS各15 μL，待渗入后用10 μmol/L PBS洗涤3次，加入胶体金标记抗人IgM,观察结果，阳性者在膜中央出现红色斑点，阴性者则无红色斑点形成. HCMVIgM ELISA的检测按试剂盒说明书操作. CGIDA检测120份HCMVIgM阳性血清标本，同时检测100例单纯疱疹病毒Ⅰ型IgM阳性血清标本. 免疫斑点检测试剂在4℃下放置6 mo,每月检测抗HCMVIgM阳性及阴性血清各30份. 于37℃和4℃均放置1 wk,然后分别检测阳性和阴性血清各50例作稳定性试验.
2结果
2.1目的基因的PCR扩增PCR扩增产物长度为651 bp，其中目的基因为624 bp，扩增产物两端引入限制性内切酶识别位点序列、保护性碱基共27 bp. 核苷酸片段大小与预期值一致，阴性对照未增出特异性片段（Fig 1）.
2.2原核重组表达质粒的鉴定少量碱裂解法快速提取重组质粒经EcoR I及HindⅢ双酶切后电泳见2条带,分别约为6.7 kb和624 bp，与预测结果一致，证明重组克隆成功（Fig 2）.
2.3SDSPAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色鉴定重组蛋白的检测分析菌体裂解液，表明诱导表达产物主要存在包涵体中. SDSPAGE蛋白电泳显示pMAlP2PP150克隆全菌裂解物在Mr 64 000的位置出现一条蛋白条带，而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的无蛋白条带；含质粒pMAlP2的诱导菌则在Mr 43 000位置出现一条带. 电泳结果与理论预测值相一致. 另外，从蛋白带型来看，诱导5 h的融合蛋白表达量最高，经凝胶成像系统扫描分析，融合蛋白含量占全菌体的10%. 纯化的融合蛋白经SDSPAGE及考马斯亮蓝染色后，融合蛋白Mr 64 000位置出现一清晰蛋白条带，pMALp2转化菌诱导表达的MBP则出现于Mr 43 000位置.