甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术(一)

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作者：吴安平 殷少华 熊飞 胡海珍

　　摘要利用小孢子加倍培养技术可以培育基因纯合、稳定的遗传材料,掌握该技术对加速育种进度有重要意义。从选取花蕾、游离小孢子分离、小孢子加倍培养、胚诱导培养、胚状体培养、再生苗培养、再生植株倍性鉴定等方面总结了甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术。
　　关键词甘蓝型油菜;小孢子;加倍培养

　　自Lichter等[1]1981年首次报道了甘蓝型油菜游离小孢子培养并成功获得了再生苗,在后来的20多年里,国内外学者已经成功地在甘蓝型油菜中建立了小孢子培养技术体系,特别是用此种方法从培育的DH群体中获得的多种油菜品种已经在生产中得到了广泛的认可。现将甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术介绍如下。
　　
　　1选取花蕾
　　
　　一般在天气晴朗的8~10时取材,如遇阴雨天气,为了不影响试验进程也可取材,但一定要选取生长良好的花序,研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生。尽量选取主花序或生长状态较好的花序,然后在实验室选取大小在2.5~3.5mm的花蕾备用。不同的材料花蕾的发育时期不尽相同,可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期,最佳时期为单核晚期至二核期。花药为淡绿色呈透明状。取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取,应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。
　　
　　2游离小孢子分离
　　
　　先用75%的医用酒精将花蕾表面灭菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用无菌水冲漂洗3次,每次5min。将消毒的花蕾置于灭过菌的玻璃管中,加约2mL B5提取液,用灭菌玻璃棒将花蕾研碎,压出花粉小孢子,通过2层槽式无菌滤纸,或45μm的尼龙网,或0.22μm孔径的微孔滤膜过滤,把滤液倒入灭菌了的带盖的10mL离心管里,用滴管吸B5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉,冲2~3次后,在10mL离心管中将花粉悬浮液稀释;将花粉悬浮液离心,800rpm,离心5min;将离心管中的上层清液吸去,再加液体B5抽提液,并将沉淀的花粉用吸管冲散,再次悬浮离心(用封口膜封口),1 800rpm,离心5min,吸去上层清液。
　　
　　3小孢子加倍培养
　　
　　将沉淀的花粉用NLN-16 液体培养基稀释,稀释不要超过10mL,因为加倍后还要在10mL的离心管中再次稀释离心,倒入三角瓶在32℃条件下暗培养2d左右(48~72h);然后检查是否有污染,如果没有污染,则分皿继续培养。
　　
　　4胚诱导培养
　　
　　将加倍后的NLN-16花粉悬浮液倒入离心管离心,800rpm,离心5min,倒掉NLN-16液体;将沉淀的花粉用NLN-13培养液稀释,稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿,一般每皿加入悬浮液3mL左右,含花蕾1.5~2.0个/mL,小孢子密度为10~50万个/mL,用封口膜封口;将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养,10d左右开始查看是否有可见的颗粒状胚,如果没有则继续培养[2]。